Daftar Isi
- Tujuan dan Dasar Validasi Metode Analitik
- Ruang Lingup Pelaksanaan Validasi
- Tanggung Jawab dan Akuntabilitas
- Definisi Istilah Kunci dalam Validasi
- Persyaratan Umum Pelaksanaan Validasi
- Pemilihan Sampel dan Standar
- Validasi Metode Assay dan Kandungan Pengawet
- Uniformitas Kandungan (Content Uniformity)
- Validasi Zat Terkait (Related Substances) Produk Jadi
- Validasi Assay Bahan Baku Aktif (Drug Substance)
- Analisis Spesifisitas dan Selektivitas Metode
- Linearitas dan Rentang Pengukuran
- Presisi: Sistem, Metode, dan Presisi Antara
- Akurasi dan Studi Pemulihan (% Recovery)
- Studi Pengaruh Filter terhadap Hasil Analisis
- Stabilitas Larutan Analitik dan Fase Gerak
- Evaluasi Robustness Metode Analitik
- Validasi Zat Terkait untuk Bahan Baku Aktif
- Penomoran Protokol dan Laporan Validasi
- Revalidasi dan Kondisi Pemicu
- Dokumentasi dan Pengelolaan Data Validasi
1. Tujuan dan Dasar Validasi Metode Analitik
Validasi metode analitik merupakan fondasi utama dalam menjamin keandalan hasil pengujian di laboratorium farmasi. Tanpa validasi yang memadai, setiap data analisis yang dihasilkan tidak memiliki dasar ilmiah yang kuat untuk mendukung keputusan pelepasan batch produk obat. Oleh karena itu, setiap laboratorium Quality Control (QC) wajib menyusun prosedur tertulis yang komprehensif mengenai validasi dan verifikasi metode analitik.
Tujuan utama dari penetapan prosedur ini adalah untuk memastikan bahwa seluruh metode analitik yang digunakan dalam pengujian produk obat telah terbukti layak dan sesuai untuk tujuan analisis yang dimaksud. Metode yang telah divalidasi harus mampu menghasilkan data yang akurat, presisi, dan dapat direproduksi sesuai dengan persyaratan regulasi yang berlaku, termasuk pedoman ICH (International Council for Harmonisation) dan standar farmakope yang diakui.
Validasi metode analitik menjadi krusial karena hasil pengujian yang dihasilkan dari metode inilah yang akan menjadi dasar penentuan apakah suatu batch produk obat memenuhi spesifikasi kualitas atau tidak. Jika metode analitik tidak valid, maka risiko pelepasan produk yang tidak memenuhi standar atau penolakan produk yang sebenarnya memenuhi standar menjadi sangat tinggi, yang pada akhirnya berdampak pada keamanan pasien dan integritas rantai pasok farmasi.
2. Ruang Lingkup Pelaksanaan Validasi
Prosedur validasi dan verifikasi metode analitik ini berlaku untuk seluruh kegiatan validasi yang dilaksanakan di departemen Quality Control. Ruang lingkup penerapannya mencakup berbagai kategori pengujian yang dilakukan terhadap produk farmasi, antara lain:
Untuk produk obat jadi (drug products), validasi mencakup metode pengujian Assay (kadar), Zat Terkait (Related Substances), Uniformitas Kandungan (Content Uniformity), serta Kandungan Pengawet (Preservative Content). Masing-masing jenis pengujian ini memiliki parameter validasi yang spesifik karena kompleksitas matriks produk dan target analit yang berbeda.
Selain itu, validasi juga diperlukan untuk metode pengujian bahan baku aktif atau drug substance, khususnya untuk pengujian Assay yang menjadi penentu kemurnian dan potensi bahan baku yang digunakan dalam proses manufaktur. Bahan baku aktif yang tidak teruji dengan metode yang valid berpotensi menghasilkan produk jadi yang tidak konsisten dalam hal dosis dan efektivitas terapeutik.
Prosedur ini juga berlaku untuk metode analitik yang bersumber dari farmakope resmi (compendial methods) maupun metode yang dikembangkan sendiri oleh laboratorium (in-house methods). Setiap metode kompendial tetap memerlukan verifikasi untuk memastikan bahwa metode tersebut berkinerja dengan baik di bawah kondisi laboratorium yang sesungguhnya, termasuk peralatan, kondisi lingkungan, dan kompetensi analis yang digunakan.
3. Tanggung Jawab dan Akuntabilitas
Pelaksanaan validasi metode analitik melibatkan beberapa tingkatan tanggung jawab yang terstruktur untuk memastikan kualitas dan integritas seluruh dokumen serta data yang dihasilkan.
Petugas tingkat Officer dan di atasnya bertanggung jawab atas penyusunan prosedur operasional standar (SOP), penetapan nomor Analitical Report (AR), serta pelaksanaan studi validasi atau verifikasi di laboratorium. Mereka adalah pihak yang secara langsung terlibat dalam pengumpulan data dan eksekusi protokol validasi di lapangan.
Eksekutif dan level di atasnya memiliki tanggung jawab untuk melakukan review dan pemeriksaan terhadap seluruh dokumen SOP serta dokumen validasi yang dihasilkan. Tahap review ini sangat penting sebagai kontrol kualitas internal sebelum dokumen disahkan oleh pejabat yang berwenang.
Head Quality Assurance dan Quality Control bertanggung jawab atas persetujuan akhir terhadap prosedur validasi. Mereka memastikan bahwa seluruh aspek regulasi dan persyaratan standar telah terpenuhi sebelum prosedur dapat diterapkan secara resmi di laboratorium.
Secara keseluruhan, implementasi dan kepatuhan terhadap prosedur ini menjadi akuntabilitas utama dari Kepala Departemen Quality Control. Kepala QC harus memastikan bahwa seluruh analis dan staf laboratorium memahami dan menjalankan prosedur validasi sesuai dengan ketentuan yang telah ditetapkan.
4. Definisi Istilah Kunci dalam Validasi
Untuk memastikan pemahaman yang seragam di seluruh tim laboratorium, berikut adalah definisi dari istilah-istilah kunci yang digunakan dalam pelaksanaan validasi metode analitik:
Validasi adalah demonstrasi atau pembuktian secara ilmiah bahwa suatu metode analitik memenuhi syarat untuk tujuan penggunaan yang dimaksud. Validasi melibatkan serangkaian pengujian terhadap parameter-parameter kunci metode untuk memastikan kinerjanya konsisten dan dapat diandalkan.
Verifikasi adalah konfirmasi bahwa suatu metode kompendial yang sudah divalidasi sebelumnya dapat berkinerja dengan baik di bawah kondisi laboratorium aktual yang diterapkan. Verifikasi bersifat lebih sederhana dibandingkan validasi penuh karena metode kompendial telah melewati proses validasi yang ketat oleh badan farmakope.
Spesifisitas atau Selektivitas adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur analit secara tegas dan tanpa ambiguitas di hadapan komponen-komponen lain seperti impuritas, produk degradasi, dan eksipien. Spesifisitas menjadi parameter validasi yang paling fundamental karena menentukan apakah metode benar-benar mengukur senyawa target yang diinginkan.
Batas Deteksi (Limit of Detection / LOD) adalah jumlah paling rendah dari analit yang dapat dideteksi oleh metode, meskipun belum tentu dapat dikuantifikasi secara akurat. LOD sangat penting dalam pengujian zat terkait dan impuritas di mana konsentrasi target sangat rendah.
Batas Kuantitasi (Limit of Quantitation / LOQ) adalah jumlah paling rendah dari analit yang dapat dikuantifikasi dengan akurasi dan presisi yang dapat diterima. LOQ menjadi batas bawah rentang kuantitatif metode dan menjadi acuan dalam pelaporan hasil pengujian impuritas.
Linearitas adalah kemampuan suatu metode untuk menghasilkan hasil yang berbanding lurus dengan konsentrasi analit dalam rentang konsertrasi tertentu. Linearitas ditunjukkan oleh nilai koefisien korelasi (r) yang tinggi antara konsentrasi dan respons instrumen.
Rentang (Range) adalah interval antara konsentrasi terendah dan tertinggi di mana akurasi, presisi, dan linearitas telah dibuktikan secara memadai. Rentang ini menjadi parameter penting dalam menentukan cakupan penggunaan metode.
Presisi adalah kedekatan kesepakatan antara beberapa pengukuran dari sampel homogen yang sama. Presisi dilaporkan dalam bentuk persentase RSD (Relative Standard Deviation) dan terdiri dari tiga tingkatan: presisi sistem, presisi metode (repeatability), dan presisi antara (intermediate precision).
Akurasi adalah kedekatan kesepakatan antara nilai benar yang diterima dan nilai yang ditemukan oleh metode pengujian. Akurasi dievaluasi melalui studi pemulihan (recovery study) di mana analit ditambahkan ke dalam matriks sampel pada berbagai tingkat konsentrasi.
5. Persyaratan Umum Pelaksanaan Validasi
Sebelum memulai pelaksanaan validasi, terdapat beberapa persyaratan umum yang harus dipenuhi untuk memastikan kualitas dan integritas data yang dihasilkan. Validasi atau verifikasi harus dilaksanakan setelah tahap pengembangan metode selesai dan sebelum metode digunakan untuk pengujian rutin secara reguler.
Seluruh aktivitas validasi harus mematuhi pedoman ICH yang berlaku. Setiap deviasi yang terjadi selama pelaksanaan validasi harus memiliki justifikasi ilmiah yang kuat dan didokumentasikan dengan lengkap. Tanpa justifikasi yang memadai, deviasi tersebut dapat menggugurkan seluruh proses validasi.
Sebelum inisiasi validasi, beberapa verifikasi awal harus dilakukan terlebih dahulu. Pertama, status kualifikasi dan kalibrasi instrumen harus dipastikan masih berlaku. Penggunaan instrumen yang belum terkalibrasi atau kualifikasinya sudah kedaluwarsa akan menghasilkan data yang tidak valid secara regulasi.
Kedua, reagen yang digunakan harus memenuhi grade minimum AR (Analytical Reagent), HPLC, atau GR (Guaranteed Reagent) sesuai dengan persyaratan metode. Penggunaan reagen dengan grade yang lebih rendah dari yang dipersyaratkan dapat mempengaruhi sensitivitas dan akurasi metode.
Ketiga, standar rujukan atau standar kerja yang digunakan harus dalam kondisi masih berlaku dan memiliki sertifikat analisis (Certificate of Analysis / COA) yang lengkap. Standar yang sudah kedaluwarsa atau tidak memiliki COA dapat menghasilkan data kalibrasi yang tidak akurat.
Keempat, peralatan gelas kelas A harus digunakan untuk seluruh persiapan larutan. Peralatan gelas kelas A memiliki toleransi akurasi yang lebih ketat dibandingkan kelas lainnya dan menjadi persyaratan mutlak untuk analisis kuantitatif.
Kelima, material yang tidak stabil atau berbahaya harus diidentifikasi terlebih dahulu beserta kondisi penyimpanannya yang sesuai. Hal ini penting untuk menjaga stabilitas analit selama proses analisis berlangsung.
Jika standar impuritas tidak tersedia, nilai RRT (Relative Retention Time) atau RRF (Relative Response Factor) dari farmakope, DMF (Drug Master File), atau paket teknis API dapat digunakan sebagai referensi. Penggunaan RRT/RRF dari sumber-sumber ini harus didokumentasikan dan divisasi secara terpisah.
Untuk metode kompendial, verifikasi yang dilakukan secara umum mencakup evaluasi terhadap parameter spesifisitas, presisi, akurasi, stabilitas larutan analitik, serta studi pengaruh filter jika applicable untuk jenis pengujian yang dilakukan.
6. Pemilihan Sampel dan Standar
Pemilihan sampel yang tepat merupakan faktor kritis dalam keberhasilan validasi metode analitik. Keputusan mengenai jenis dan jumlah sampel harus dipertimbangkan dengan cermat untuk memastikan bahwa validasi menghasilkan data yang representatif dan relevan dengan kondisi analisis rutin.
Untuk produk dengan beberapa kekuatan dosis (scaled strengths), validasi harus dilakukan pada kekuatan dosis tertinggi karena kondisi ini mewakili tantangan analitis terbesar dari segi konsentrasi analit dalam matriks. Sebaliknya, untuk formulasi yang memiliki kemiripan fisik antar kekuatan dosis (look-alike formulations), validasi dilakukan pada kekuatan dosis terendah karena matriks dengan konsentrasi analit terendah memiliki tantangan deteksi yang lebih besar.
Penggunaan satu batch sampel saja lebih disukai dalam pelaksanaan validasi karena dapat mengeliminasi variabilitas antar batch sebagai sumber ketidakpastian. Namun, jika dua batch harus digunakan dalam studi validasi, maka presisi antara (intermediate precision) harus ditetapkan untuk mengakomodasi variabilitas antar batch tersebut.
Untuk standar dan impuritas, harus digunakan standar rujukan atau standar kerja yang telah terkarakterisasi dengan baik. Sertifikat analisis (COA) dari standar yang digunakan harus dilampirkan dalam dokumentasi validasi sebagai bukti tracing. Jika applicable, impuritas harus ditambahkan (spiked) ke dalam sampel pada tingkat spesifikasi untuk menguji kemampuan metode dalam mendeteksi dan mengkuantifikasi impuritas pada batas spesifikasi.
7. Validasi Metode Assay dan Kandungan Pengawet
Validasi metode untuk pengujian Assay (kadar) dan kandungan pengawet merupakan salah satu aspek paling penting dalam validasi metode analitik farmasi. Parameter validasi yang harus dilakukan untuk metode internal (in-house) mencakup kesesuaian sistem (system suitability), spesifisitas termasuk studi degradasi paksa (forced degradation), linearitas dan rentang, presisi pada tiga tingkatan (sistem, metode, dan antara), akurasi, robustness, stabilitas dalam larutan analitik, stabilitas fase gerak (mobile phase), serta studi pengaruh filter jika diperlukan.
Untuk verifikasi metode kompendial, parameter yang dinilai lebih ringkas dan meliputi kesesuaian sistem, spesifisitas, akurasi, presisi metode, stabilitas dalam larutan analitik, dan studi pengaruh filter. Perbedaan ini mencerminkan fakta bahwa metode kompendial telah melalui proses validasi yang komprehensif oleh badan farmakope.
Dalam evaluasi kesesuaian sistem, kriteria penerimaan harus sesuai dengan yang ditetapkan dalam metode pengujian. Jika metode tidak menetapkan kriteria spesifik, maka injeksi replika sebanyak lima kali harus dilakukan, dengan persyaratan %RSD tidak lebih dari 2% untuk pengujian Assay maupun pengawet.
8. Uniformitas Kandungan (Content Uniformity)
Uniformitas kandungan merupakan parameter validasi yang sangat penting untuk produk sediaan padat seperti tablet dan kapsul, di mana setiap unit produk harus mengandung kadar bahan aktif yang seragam. Parameter validasi untuk uniformitas kandungan mirip dengan Assay namun dengan beberapa perbedaan kriteria penerimaan yang spesifik.
Pengujian dilakukan terhadap 10 unit produk dengan kriteria Acceptance Value (AV) tidak lebih dari 15. Persyaratan %RSD untuk uniformitas kandungan ditetapkan tidak lebih dari 5%, yang lebih longgar dibandingkan Assay karena adanya variabilitas inheren antar unit produk individual.
Hasil untuk setiap unit individual harus berada dalam rentang 85% hingga 115% dari kadar yang dinyatakan, sementara untuk akurasi (recovery), rentang penerimaan ditetapkan antara 95% hingga 105%. Kriteria ini memastikan bahwa produk memiliki seragamitas kandungan yang memadai untuk menjamin dosis yang konsisten kepada pasien.
9. Validasi Zat Terkait (Related Substances) Produk Jadi
Validasi metode untuk pengujian zat terkait pada produk jadi memiliki tantangan tersendiri karena konsentrasi impuritas yang harus dideteksi dan dikuantifikasi biasanya sangat rendah, sering kali berada di tingkat ppm (parts per million). Oleh karena itu, parameter validasi mencakup parameter tambahan yang tidak diperlukan untuk pengujian Assay, yaitu LOD dan LOQ.
Untuk menentukan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ), dua metode dapat digunakan. Metode pertama adalah rasio signal-to-noise, di mana LOD ditetapkan pada rasio minimal 3:1 dan LOQ pada rasio minimal 10:1. Metode kedua adalah metode gradien (slope method), di mana LOD dihitung dengan rumus 3,3σ/S dan LOQ dengan rumus 10σ/S, dengan σ adalah deviasi standar dari intercept garis kalibrasi dan S adalah gradien (slope) garis kalibrasi.
Kriteria penerimaan untuk LOQ mensyaratkan bahwa %RSD pada tingkat LOQ tidak melebihi 15%, mencerminkan tantangan presisi pada konsentrasi yang sangat rendah. Untuk linearitas, rentang pengukuran dimulai dari LOQ hingga 150% dari spesifikasi, dengan minimal lima level konsentrasi yang diinjeksi secara tripel.
Presisi untuk pengujian zat terkait ditetapkan dengan %RSD tidak lebih dari 15% untuk impuritas yang konsentrasinya di atas atau sama dengan LOQ, dengan pemulihan (recovery) dalam rentang 80% hingga 120%. Persyaratan ini lebih longgar dibandingkan pengujian Assay karena tantangan analitis yang lebih besar pada konsentrasi rendah.
Untuk akurasi, tingkat LOQ memiliki rentang pemulihan yang lebih luas, yaitu 70% hingga 130%, sementara tingkat lainnya berada dalam rentang 80% hingga 120%. Studi pengaruh filter untuk zat terkait mensyaratkan bahwa perbedaan absolut tidak melebihi 10% dari batas spesifikasi, yang lebih longgar dibandingkan Assay karena sensitivitas metode terhadap adsorpsi analit pada media filter.
10. Validasi Assay Bahan Baku Aktif (Drug Substance)
Validasi metode untuk pengujian Assay bahan baku aktif memiliki persamaan dan perbedaan tertentu dibandingkan validasi untuk produk jadi. Untuk validasi internal (in-house), parameter yang dinilai meliputi kesesuaian sistem, spesifisitas, linearitas dan rentang, presisi, akurasi, robustness, stabilitas larutan, stabilitas fase gerak, serta studi pengaruh filter jika diperlukan.
Untuk verifikasi metode kompendial pada bahan baku aktif, parameter yang dinilai lebih terfokus pada kesesuaian sistem, spesifisitas, akurasi, presisi metode, dan stabilitas larutan. Kriteria penerimaan utama adalah %RSD tidak lebih dari 2% jika metode tidak menetapkan angka spesifik.
Dalam evaluasi spesifisitas untuk bahan baku aktif, uji gangguan (interference study) harus dilakukan dengan menyiapkan dan menganalisis blanko, larutan kesesuaian sistem, larutan standar, dan larutan sampel sesuai dengan metodologi yang telah divalidasi. Untuk metode HPLC isokratis, spesifisitas dapat dikonfirmasi dengan memperpanjang waktu analisis kromatografis untuk memastikan tidak ada puncak gangguan yang elusi bersamaan dengan puncak analit.
Untuk metode spektrofotometri UV, prosedur validasi meliputi pemindaian (scan) blanko, standar, dan sampel dalam rentang gelombang UV 200-400 nm. Pada metode UV-Visible, pemindaian dilakukan dalam rentang yang lebih luas, yaitu 200-700 nm. Absorbansi dicatat pada panjang gelombang kerja yang ditentukan untuk memastikan spesifisitas pengukuran.
11. Analisis Spesifisitas dan Selektivitas Metode
Spesifisitas merupakan parameter validasi yang paling kritis karena menentukan apakah metode analitik benar-benar mengukur senyawa target tanpa gangguan dari komponen lain yang hadir dalam sampel. Evaluasi spesifisitas dilakukan melalui studi gangguan yang komprehensif.
Untuk metode HPLC, kriteria penerimaan spesifisitas mensyaratkan bahwa kriteria kesesuaian sistem harus memenuhi persyaratan metode. Tidak boleh ada puncak dari blanko atau impuritas yang dikenal yang mengelusi bersamaan (co-elute) pada waktu retensi analit. Seluruh puncak yang menjadi perhatian harus ter-resolusi dengan baik dari puncak pengganggu, baik itu impuritas maupun standar internal.
Indeks kemurnian puncak (peak purity index) harus positif dan bernilai minimal 0,995 pada sistem Lab Solutions. Untuk sistem Empower, sudut kemurnian (purity angle) harus lebih kecil dari ambang kemurnian (purity threshold). Kriteria ini memastikan bahwa puncak yang terdeteksi murni merupakan puncak analit target tanpa kontaminasi puncak lain.
Untuk metode spektrofotometri UV, tidak boleh ada gangguan dari blanko. Jika gangguan terdeteksi, besarnya gangguan tidak boleh melebihi 1,0% pada panjang gelombang yang ditetapkan. Untuk metode titrasi, konsumsi blanko tidak boleh melebihi 1,0% dari nilai titre sampel.
12. Linearitas dan Rentang Pengukuran
Linearitas menjadi parameter yang menunjukkan kemampuan metode dalam menghasilkan respons yang berbanding lurus dengan perubahan konsentrasi analit. Evaluasi linearitas dilakukan dengan menyiapkan minimal lima level konsentrasi yang mencakup rentang 50% hingga 150% dari konsentrasi target, sesuai dengan panduan ICH.
Setiap level konsentrasi diinjeksi secara tripel untuk memastikan reproduksibilitas respons. Hubungan antara konsentrasi (dalam ppm) dengan luas puncak atau absorbansi diplot pada grafik, dan parameter statistik yang dilaporkan meliputi gradien (slope), intercept, persentase Y-intercept, serta koefisien korelasi (r).
Kriteria penerimaan untuk linearitas mensyaratkan bahwa koefisien korelasi minimal 0,995 dan %RSD untuk rentang tidak melebihi 2,0%. Selain itu, gradien, intercept, dan persentase Y-intercept pada respons 100% harus dilaporkan secara lengkap dalam laporan validasi.
Untuk menentukan rentang (range) secara spesifik, injeksi replika sebanyak enam kali dilakukan pada level konsentrasi terendah dan tertinggi, dengan perhitungan %RSD untuk memastikan presisi di kedua ujung rentang pengukuran memenuhi persyaratan.
13. Presisi: Sistem, Metode, dan Presisi Antara
Presisi merupakan ukuran kesepakatan antara beberapa pengukuran berulang dari sampel yang sama, dan dilaporkan dalam bentuk persentase RSD (Relative Standard Deviation). Dalam validasi metode analitik, presisi dievaluasi pada tiga tingkatan yang berbeda untuk memberikan gambaran komprehensif mengenai reproduksibilitas metode.
Presisi Sistem (System Precision) dievaluasi dengan melakukan injeksi standar sebanyak enam kali secara berurutan pada sistem HPLC, atau tiga pengukuran absorbansi berulang pada sistem UV. Kriteria penerimaan adalah kriteria kesesuaian sistem harus memenuhi persyaratan metode.
Presisi Metode (Method Precision atau Repeatability) dievaluasi dengan menyiapkan enam preparasi sampel independen dari sampel homogen yang sama, dianalisis pada hari yang sama, menggunakan instrumen yang sama, analis yang sama, dan kolom yang sama jika applicable. Hasil analisis dihitung untuk mendapatkan kadar, nilai rata-rata, dan %RSD. Kriteria penerimaan mensyaratkan %RSD tidak lebih dari 2,0% untuk Assay.
Presisi Antara (Intermediate Precision) dievaluasi dengan menyiapkan enam preparasi sampel yang dianalisis oleh analis berbeda, instrumen berbeda, hari berbeda, dan kolom berbeda jika tersedia. Hasil dari 12 pengukuran (6 repeatability + 6 intermediate precision) dihitung secara kumulatif. Kriteria penerimaan mensyaratkan %RSD keseluruhan tidak melebihi 2,0% dan perbedaan absolut antara hasil rata-rata tidak melebihi 2,0%.
14. Akurasi dan Studi Pemulihan (% Recovery)
Akurasi metode analitik dievaluasi melalui studi pemulihan (recovery study) di mana analit ditambahkan (spiked) ke dalam matriks sampel pada berbagai tingkat konsentrasi. Evaluasi dilakukan pada tiga level, yaitu 50%, 100%, dan 150% dari konsentrasi target, dengan tiga replika pada setiap level.
Jika jumlah penambahan (spike) kurang dari 10 mg, larutan stok harus disiapkan terlebih dahulu untuk memastikan akurasi penambahan. Hasil pemulihan dihitung untuk setiap replika dan diperoleh nilai rata-rata pemulihan serta %RSD.
Kriteria penerimaan untuk akurasi Assay mensyaratkan pemulihan individu dan rata-rata berada dalam rentang 98,0% hingga 102,0%, dengan %RSD tidak lebih dari 2,0%. Untuk pengujian pengawet, rentang pemulihan yang diterima lebih luas, yaitu 90% hingga 110%, dengan %RSD tidak lebih dari 10%. Perbedaan rentang ini mencerminkan tantangan analitis yang berbeda antara pengujian Assay dan pengawet.
15. Studi Pengaruh Filter terhadap Hasil Analisis
Studi pengaruh filter merupakan bagian penting dari validasi metode analitik karena penggunaan filter dalam persiapan sampel dapat mempengaruhi konsentrasi analit yang terukur. Beberapa analit memiliki kecenderungan untuk teradsorpsi pada permukaan filter, yang dapat mengakibatkan hasil pengukuran yang lebih rendah dari nilai aktual.
Untuk melakukan studi filter, larutan sampel disiapkan kemudian disaring melalui filter yang direkomendasikan, seperti GF/C, filter nilon 0,45 µm, atau filter PVDF 0,45 µm. Air pembilas pertama sebanyak 1 mL dibuang untuk menghilangkan efek adsorpsi awal, kemudian filtrat dikumpulkan pada volume 1 mL, 3 mL, dan 5 mL setelah pembilasan.
Hasil filtrat dibandingkan dengan sampel yang tidak disaring (atau dipusatkan/dicentrifuge). Kriteria penerimaan untuk studi filter Assay mensyaratkan perbedaan absolut tidak melebihi 2,0%, sedangkan untuk pengawet batasnya 5,0%. Untuk pengujian zat terkait, perbedaan absolut tidak boleh melebihi 10% dari batas spesifikasi.
16. Stabilitas Larutan Analitik dan Fase Gerak
Evaluasi stabilitas larutan analitik sangat penting untuk menentukan waktu simpan maksimum dari larutan blanko, standar, dan sampel selama proses analisis berlangsung. Hal ini menjadi pertimbangan praktis di mana analis mungkin tidak selalu dapat menganalisis seluruh sampel secara langsung setelah persiapan.
Larutan blanko, standar, dan sampel disimpan pada suhu ruang terkontrol atau kondisi refrigerasi (2-8°C atau sesuai yang ditetapkan) dan dianalisis selama minimal 48 jam untuk metode Assay. Perubahan %RSD dan selisih kadar dibandingkan dengan pengukuran awal dievaluasi untuk menentukan stabilitas larutan.
Kriteria penerimaan mensyaratkan kumulatif %RSD tidak melebihi 2,0% dan selisih kadar tidak melebihi 2,0% selama periode evaluasi. Jika stabilitas larutan tidak memenuhi kriteria, waktu simpan harus diperpendek sesuai dengan data stabilitas yang diperoleh.
Untuk stabilitas fase gerak (mobile phase), evaluasi dilakukan selama 24 jam dengan injeksi blanko, larutan kesesuaian sistem, dan larutan standar. Kriteria penerimaan adalah kesesuaian sistem harus tetap memenuhi persyaratan dan tidak terjadi kekeruhan (haziness) pada fase gerak selama periode evaluasi.
17. Evaluasi Robustness Metode Analitik
Robustness atau ketangguhan metode mengukur kemampuan metode analitik untuk mempertahankan kinerja yang konsisten meskipun terjadi perubahan kecil dan tidak disengaja dalam kondisi analisis. Evaluasi robustness dilakukan dengan secara sengaja memvariasikan parameter-parameter metode dalam rentang yang realistis.
Parameter yang divariasikan meliputi pH larutan (±0,2 unit), laju alir mobile phase (±0,2 mL/min; atau ±0,1 mL/min untuk laju alir di bawah 1,0 mL/min), suhu kolom (±5°C), panjang gelombang UV (±2 nm), serta komposisi mobile phase (±2% absolut atau 30% relatif).
Kriteria penerimaan untuk robustness mensyaratkan bahwa kesesuaian sistem harus tetap mematuhi persyaratan metode dan selisih kadar tidak melebihi 2,0% meskipun terjadi variasi parameter. Jika hasil pengukuran berada di luar spesifikasi (out-of-specification) pada variasi tertentu, parameter kritis tersebut harus ditentukan dan dikendalikan secara lebih ketat dalam prosedur analisis rutin.
18. Validasi Zat Terkait untuk Bahan Baku Aktif
Validasi metode zat terkait untuk bahan baku aktif (drug substance) memiliki persyaratan yang lebih ketat karena impuritas dalam bahan baku aktif dapat berdampak langsung pada kualitas dan keamanan produk jadi. Parameter validasi mencakup kesesuaian sistem, spesifisitas termasuk studi degradasi paksa, LOD dan LOQ, linearitas dan rentang, presisi, akurasi, studi filter, stabilitas larutan, stabilitas fase gerak, serta robustness.
Kesesuaian sistem harus dilakukan sebelum validasi dimulai. Jika %RSD tidak ditentukan dalam metode, injeksi replika sebanyak lima kali harus dilakukan, dengan kriteria penerimaan %RSD tidak lebih dari 5,0%. Persyaratan ini mencerminkan kompleksitas kromatografi untuk pemisahan multi-analit dalam analisis zat terkait.
Evaluasi spesifisitas meliputi studi gangguan dengan menyiapkan blanko, larutan sensitivitas, larutan resolusi, standar impuritas, dan sampel yang ditambahkan impuritas (spiked). Tidak boleh terjadi ko-elusi puncak, dan indeks kemurnian puncak harus minimal 0,990. Jika terjadi saturasi puncak, pelarutan sampel harus dilakukan untuk mendapatkan respons dalam rentang linier detektor.
Studi degradasi paksa harus dilakukan di bawah berbagai kondisi stres, termasuk asam, basa, oksidasi, termal (suhu minimal 80°C), hidrolisis, fotolisis, dan kelembaban (40°C / 75% RH). Kriteria penerimaan mensyaratkan degradasi 5% hingga 30% tercapai, indeks kemurnian puncak minimal 0,990, keseimbangan massa minimal 95%, serta produk degradasi harus ter-resolusi dengan baik dari puncak analit induk.
Untuk studi linearitas zat terkait, rentang pengukuran dimulai dari LOQ hingga 150% dari spesifikasi, dengan minimal lima level konsentrasi yang diinjeksi secara tripel. Koefisien korelasi minimal 0,95 dan %RSD tidak melebihi 10% (atau 15% pada tingkat LOQ). Persyaratan ini mencerminkan kompleksitas analisis pada rentang konsentrasi yang luas dan sangat rendah.
19. Penomoran Protokol dan Laporan Validasi
Setiap protokol dan laporan validasi atau verifikasi harus memiliki nomor identifikasi unik yang memudahkan pelacakan dan pengelolaan dokumen. Sistem penomoran yang digunakan mengikuti format: QCD / AMV / AA / BBB – C.
Keterangan kode penomoran adalah sebagai berikut: QCD mewakili Quality Control Department (Departemen Pengendalian Kualitas), AMV mewakili Analytical Method Validation/Verification (Validasi/Verifikasi Metode Analitik), AA adalah kode kategori produk (FP untuk Finished Product atau produk jadi, RM untuk Raw Material atau bahan baku), BBB adalah nomor urut yang dimulai dari 001 dan seterusnya, serta C adalah kode jenis dokumen (P untuk Protocol atau protokol, R untuk Report atau laporan).
Dokumen addendum atau lampiran harus menggunakan nomor yang sama dengan dokumen induknya, namun dilengkapi dengan referensi addendum untuk membedakan versi dokumen. Sistem penomoran yang konsisten ini memastikan bahwa seluruh dokumen validasi dapat dilacak secara audit dan memenuhi persyaratan integritas data.
20. Revalidasi dan Kondisi Pemicu
Revalidasi merupakan proses pengulangan validasi yang diperlukan ketika terjadi perubahan signifikan terhadap komponen-komponen yang dapat mempengaruhi kinerja metode analitik. Kondisi yang memicu revalidasi meliputi perubahan metode analitik itu sendiri, penambahan impuritas baru yang perlu dideteksi, serta perubahan formulasi atau rumus manufaktur produk.
Terdapat dua jenis revalidasi yang diterapkan berdasarkan tingkat perubahan yang terjadi. Untuk perubahan kecil (minor changes), revalidasi parsial dilakukan, yaitu hanya parameter-parameter yang terpengaruh oleh perubahan yang dievaluasi ulang. Untuk perubahan besar (major changes), revalidasi penuh dilakukan, mencakup seluruh parameter validasi sebagaimana validasi awal.
Nomor revisi dokumen validasi harus diperbarui setelah revalidasi selesai, misalnya dari 00 menjadi 01, untuk mencerminkan bahwa dokumen tersebut telah mengalami pembaruan. Pelacakan riwayat revisi menjadi penting dalam menjaga jejak audit (audit trail) yang komprehensif.
21. Dokumentasi dan Pengelolaan Data Validasi
Dokumentasi yang komprehensif dan akurat merupakan pilar utama dari validasi metode analitik yang berhasil. Protokol validasi harus disiapkan sebelum pelaksanaan validasi dimulai, bukan setelahnya, untuk memastikan bahwa seluruh aktivitas dirancang secara sistematis dan dapat direproduksi.
Seluruh data berat, reagen, dan standar yang digunakan selama pelaksanaan validasi harus didokumentasikan dengan lengkap. Kromatogram, data mentah, serta hasil analisis harus dicatat dan dilampirkan dalam laporan validasi. Untuk analisis kritis, studi kelayakan metode (method feasibility study) harus dilakukan sebelum validasi formal dimulai.
Pelaksanaan validasi harus dilakukan oleh petugas dengan tingkat Officer/Executive atau di atasnya. Semua dokumen validasi dalam bentuk soft copy harus disimpan selama minimal lima tahun sesuai dengan persyaratan retensi dokumen regulasi. Rencana validasi harus didiskusikan dengan Kepala Departemen sebelum pelaksanaan untuk memastikan keselarasan dengan prioritas dan sumber daya laboratorium.
