Daftar Isi
- Tujuan dan Ruang Lingkup
- Tanggung Jawab
- Prosedur Kerja
- Interpretasi Hasil
- Tindakan Pencegahan
- Dokumentasi
1. Tujuan dan Ruang Lingkup
Prosedur Operasional Standar (SOP) pewarnaan Gram ini dirancang untuk menetapkan metode baku dalam melakukan pewarnaan Gram sebagai teknik diferensiasi mikroorganisme menjadi gram positif dan gram negatif di laboratorium mikrobiologi farmasi. Pewarnaan Gram merupakan metode fundamental dalam identifikasi mikroba yang telah digunakan secara luas di berbagai industri, termasuk industri farmasi, untuk tujuan kontrol mutu, investigasi kontaminasi, dan karakterisasi bioburden.
Metode ini berdasarkan perbedaan komposisi dinding sel antara bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal sehingga mampu menahan kompleks kristal violet-iodin, sedangkan bakteri gram negatif memiliki membran luar dan lapisan peptidoglikan yang lebih tipis sehingga mudah kehilangan pewarna primer selama proses dekolorisasi dan akan terwarna oleh pewarna kontras (safranin).
SOP ini berlaku untuk seluruh aktivitas pewarnaan Gram yang dilakukan di laboratorium mikrobiologi unit kontrol mutu, termasuk pengujian bioburden, kontrol lingkungan, dan investigasi mikrobiologi.2. Tanggung Jawab
Analis Mikrobiologi atau jabatan lebih tinggi di Laboratorium Mikrobiologi:
- Menyiapkan dan melaksanakan prosedur pewarnaan Gram sesuai dengan instruksi yang tercantum dalam SOP ini.
- Melakukan pencatatan hasil pengamatan secara akurat dan lengkap pada formulir laboratorium.
- Mempertahankan kebersihan dan ketertiban area kerja selama dan setelah prosedur berlangsung.
- Laporan hasil pewarnaan Gram termasuk morfologi sel, susunan sel, dan reaksi gram harus dicatat dalam buku catatan laboratorium.
- Memastikan semua peralatan dan bahan yang digunakan dalam keadaan bersih dan siap pakai.
Kepala Bagian Mikrobiologi atau pengganti yang ditunjuk:
- Mereview dan memeriksa kelengkapan serta ketepatan pelaksanaan prosedur pewarnaan Gram.
- Memastikan pelaksanaan prosedur sesuai dengan standar operasional yang berlaku.
- Memberikan instruksi perbaikan jika terdapat penyimpangan dari prosedur.
- Memverifikasi hasil interpretasi pewarnaan Gram yang dicatat oleh analis.
Kepala Kontrol Mutu atau pengganti yang ditunjuk:
- Memastikan kepatuhan terhadap SOP ini di seluruh unit kerja terkait.
- Melakukan audit periodik terhadap pelaksanaan prosedur pewarnaan Gram.
- Mengevaluasiefektivitas prosedur dan merekomendasikan perbaikan jika diperlukan.
3. Prosedur Kerja
3.1 Persiapan Bahan dan Alat
Berikut adalah reagen, bahan, dan peralatan yang diperlukan untuk melakukan pewarnaan Gram:
- Kristal violet sebagai pewarna primer (primary stain)
- Gram iodin sebagai mordant untuk membentuk kompleks pewarna
- Alkohol 95% sebagai agen dekolorisasi
- Safranin sebagai pewarna kontras (counterstain)
- Kaca benda (glass slide) yang bersih dan bebas lemak
- Langkah inokulasi steril atau cotton bud steril
- Pembakar Bunsen atau pembakar spiritus
- Air suling atau air aquabides
- Kertas hisap (blotting paper) atau kertas tisu bersih
- Mikroskop cahaya dengan objektif perendaman minyak (oil immersion 100x)
- Minyak perendaman (immersion oil) khusus mikroskop
- Label atau spidol untuk penandaan kaca benda
3.2 Preparasi Sediaan (Smear)
Langkah-langkah preparasi sediaan mikroskopis adalah sebagai berikut:
3.2.1 Ambillah satu loop inokulasi dari biakan murni mikroorganisme yang akan diuji menggunakan langkah inokulasi yang telah disterilkan terlebih dahulu dengan cara membakarnya sampai merah menyala pada pembakar Bunsen.
3.2.2 Oleskan koloni mikroorganisme tersebut secara tipis dan merata pada permukaan kaca benda yang telah bersih. Untuk biakan cair, ambil satu loop biakan dan encerkan dalam setetes air suling di atas kaca benda sebelum dianginkan.
3.2.3 Biarkan sediaan mengering secara alami pada suhu ruangan. Jangan mengeringkan sediaan di atas pembakar atau dalam oven karena dapat merusak morfologi sel mikroba.
3.3 Fiksasi Panas
Fiksasi bertujuan untuk mematikan mikroorganisme dan menempelkan sel pada kaca benda:
3.3.1 Lewatkan kaca benda yang telah kering melalui nyala api pembakar Bunsen sebanyak tiga kali dengan sisi sediaan menghadap ke atas. Lakukan dengan gerakan cepat agar sediaan tidak terlalu panas.
3.3.2 Biarkan kaca benda mendingin pada suhu ruangan sebelum dilakukan pewarnaan. Sentuh punggung tangan untuk memastikan suhu sudah aman.
3.4 Prosedur Pewarnaan
Tahapan pewarnaan Gram dilakukan secara berurutan sebagai berikut:
3.4.1 Tuangkan larutan kristal violet secara penuh hingga menutupi seluruh permukaan sediaan. Biarkan bekerja selama kurang lebih satu menit.
3.4.2 Bilas perlahan-lahan dengan aliran air suling yang bersih untuk menghilangkan kelebihan pewarna.
3.4.3 Tuangkan larutan Gram iodin hingga menutupi sediaan. Biarkan selama satu menit untuk membentuk kompleks kristal violet-iodin yang tidak larut dalam sel gram positif.
3.4.4 Bilas kembali dengan air suling sampai bersih.
3.4.5 Dekolorisasi dilakukan dengan menambahkan alkohol 95% tetes demi tetes hingga cairan yang mengalir menjadi bening. Proses ini berlangsung selama 10 hingga 20 detik untuk sediaan tipis. Hati-hati jangan sampai terlalu lama karena dapat menyebabkan dekovlorisasi berlebih.
3.4.6 Segera bilas dengan air suling untuk menghentikan proses dekolorisasi dan mencegah sel kehilangan warna secara berlebihan.
3.4.7 Tambahkan larutan safranin sebagai pewarna kontras selama 20 hingga 30 detik.
3.4.8 Bilas dengan air suling dan keringkan dengan menjepit menggunakan kertas hisap atau tisu laboratorium secara lembut. Jangan menggosok sediaan karena dapat merusak preparat.
3.5 Pemeriksaan Mikroskopis
Setelah preparat siap, lakukan pemeriksaan mikroskopis:
3.5.1 Teteskan satu tetes minyak perendaman di atas sediaan yang telah diwarnai.
3.5.2 Amati preparat di bawah mikroskop cahaya dengan objektif perendaman minyak 100x. Pastikan mikroskop dalam kondisi optimal dan telah dikalibrasi sesuai SOP sebelum digunakan untuk pemeriksaan.
3.5.3 Amati morfologi sel, susunan sel, dan karakteristik pewarnaan. Dokumentasikan hasil pengamatan dalam buku catatan laboratorium.
4. Interpretasi Hasil
Interpretasi hasil pewarnaan Gram dilakukan berdasarkan karakteristik warna dan morfologi sel yang diamati:
4.1 Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu dari kristal violet karena dinding sel peptidoglikan yang tebal menahan kompleks pewarna. Sel-sel ini akan tampak berwarna ungu tua hingga violet di bawah mikroskop.
4.2 Bakteri gram negatif akan kehilangan pewarna primer selama proses dekolorisasi karena membran luar dan dinding sel yang tipis. Sel-sel ini akan menyerap pewarna kontras safranin sehingga tampak berwarna merah atau pink.
4.3 Morfologi sel yang dapat diamati meliputi bentuk kokus (bulat), basil (batang), spirilum (spiral), serta susunan seperti rantai, berkelompok, atau berpasangan. Catatan morfologi harus dicantumkan dalam laporan hasil pengujian. Untuk identifikasi lebih lanjut terhadap bakteri pembentuk spora, dapat dilakukan pewarnaan spora sebagai teknik pewarnaan diferensial tambahan.
5. Tindakan Pencegahan dan Keamanan
Pastikan langkah-langkah berikut diterapkan selama pelaksanaan pewarnaan Gram:
5.1 Gunakan biakan muda yang berumur 18 hingga 24 jam untuk mendapatkan hasil pewarnaan yang akurat dan representatif. Biakan yang terlalu tua dapat memberikan hasil yang tidak konsisten.
5.2 Pastikan sediaan dibuat tipis agar proses dekolorisasi berjalan optimal. Sediaan yang terlalu tebal dapat menyebabkan dekolonisasi tidak sempurna dan hasil yang misleading.
5.3 Kontrol waktu dekolorisasi dengan cermat. Dekolorisasi berlebihan dapat menghasilkan假 negatif, sedangkan dekolonisasi kurang dapat menghasilkan假 positif.
5.4 Tangani kaca benda dengan hati-hati untuk menghindari kontaminasi silang dan pecahnya preparat. Gunakan penjepit kaca benda jika diperlukan.
5.5 Pastikan fiksasi panas dilakukan dengan tepat untuk mencegah hilangnya sediaan saat pencucian, namun jangan berlebihan karena dapat mengubah morfologi sel.
5.6 Bekerjalah di area yang berventilasi baik dan gunakan alat pelindung diri seperti sarung tangan dan jas laboratorium sesuai prosedur K3 laboratorium.
5.7 Buang limbah cair pewarna sesuai dengan prosedur pengelolaan limbah B3 laboratorium farmasi.
6. Dokumentasi
Seluruh aktivitas pewarnaan Gram harus didokumentasikan secara lengkap dan akurat dalam catatan laboratorium. Informasi yang wajib dicatat meliputi:
- Nama organisme atau nama sampel yang diuji
- Tanggal pelaksanaan pewarnaan Gram
- Identitas analis yang melakukan pengujian
- Hasil pengamatan meliputi reaksi gram (positif atau negatif), morfologi sel, dan susunan sel
- Nama reagen dan lote yang digunakan beserta tanggal kadaluarsa
- Tanda tangan analis sebagai penanggung jawab pelaksanaan
- Tanda tangan reviewer atau supervisor sebagai verifikasi hasil
Dokumentasi ini menjadi bagian dari records quality control yang harus disimpan sesuai dengan retensi dokumen yang berlaku di perusahaan farmasi. Data hasil pewarnaan Gram juga dapat digunakan sebagai dasar investigasi kontaminasi, pemantauan bioburden, dan penentuan tindak lanjut kontrol mutu produk.
Sumber artikel asli: https://pharmaguidances.com/sop-on-gram-staining/
