Apa itu Volume Mati
Volume mati juga disebut volume kolom ekstra, yang lebih jelas. Ini terdiri dari volume sistem HPLC antara titik injeksi dan titik deteksi, tetapi tidak termasuk bagian kolom yang berisi pengepakan.
Oleh karena itu meliputi volume injeksi, volume injektor, volume pipa sambungan sebelum dan sesudah kolom, volume fitting ujung kolom, termasuk frit, dan volume detektor. Sebenarnya, tepatnya, ini mencakup setengah volume injeksi dan setengah volume detektor.
Hal ini menyebabkan penyebaran pita ekstra kolom. Penyebaran pita berarti bahwa puncak menjadi lebih luas ketika mengalir melalui volume ekstra kolom. Hal ini tidak diinginkan karena dapat merusak beberapa pemisahan yang dicapai dalam kolom.
Apa itu Volume Tinggal?
Volume tinggal bertanggung jawab atas waktu tunda untuk gradien. Ini adalah volume sistem HPLC gradien antara ruang pencampuran dan saluran masuk kolom. Volume ini tentu saja juga ada pada elusi isokratik, namun dalam kasus tersebut, volume ini tidak berdampak pada pemisahan.
Ini mencakup volume pencampur gradien, pipa penghubung ke pompa, kepala pompa dan katup periksa, pipa antara pompa dan injektor, injektor itu sendiri, dan pipa antara injektor dan saluran masuk kolom.
Saat memulai gradien, kolom tidak mengalami perubahan komposisi eluen sampai gradien melewati volume diam.
Selama waktu tersebut, kolom dioperasikan pada elusi isokratik. Perhatian harus diberikan ketika mentransfer metode gradien dari satu instrumen ke instrumen lainnya. Jika volume diam berbeda, waktu retensi kemungkinan besar juga akan berbeda, meskipun metode dan kolomnya sama.
Volume tinggal sama dengan waktu antara injeksi dan setengah tinggi jejak detektor, dikalikan dengan laju aliran.
Bagaimana cara mengukur volume tinggal?
Putuskan sambungan kolom dari sistem. Kemudian jalankan gradien langkah dari metanol ke metanol dengan 10 mg/L propil paraben, menggunakan detektor UV. Detektor UV akan mendeteksi jejak berbentuk S. Kemudian ukur waktu tunda dari titik awal gradien hingga titik ketika setengah tinggi anak tangga tercapai. Mengalikan waktu ini dengan laju aliran menghasilkan penundaan gradien atau volume diam.
Bagaimana cara mengukur volume ekstra kolom?
Total volume ekstra kolom dan penyebaran pita ekstra kolom hanya dapat diukur dengan menggunakan peralatan khusus. Ini mencakup kelengkapan ujung kolom dan frit di kolom, yang tidak dapat diakses oleh pengguna. Jadi kita hanya perlu percaya bahwa produsen kolom telah melakukan pekerjaannya dengan baik dan meminimalkan bagian volume kolom tambahan tersebut. Apa yang bisa kita lakukan dengan mudah adalah mengukur volume kolom ekstra yang terkait dengan sistem HPLC. Untuk tujuan itu kita cukup memutuskan sambungan kolom dan menggantinya dengan gabungan “volume mati nol”.
Kemudian kami menyuntikkan sejumlah kecil sampel dan mencatat respons detektor. Contoh responnya ditunjukkan pada gambar.
Dari “kromatogram” ini kita dapat menentukan volume kolom tambahan dan penyebaran pita ekstra kolom. Volume ekstra kolom sebenarnya adalah jarak dari titik injeksi ke pusat gravitasi puncak.
Untuk menentukannya kita perlu menghitung momen puncak pertama. Namun, kita tidak harus terlalu teliti dan untuk mempermudah kita dapat menggunakan jarak antara titik injeksi dan puncak maksimum sebagai ukuran volume mati sistem.
Bagaimana cara mengukur penyebaran pita ekstra kolom?
Kita dapat menggunakan deviasi standar puncak sebagai ukuran penyebaran pita sistem. Simpangan baku puncak dapat dihitung dari momen puncak kedua. Cara yang lebih mudah adalah dengan mengukur lebar puncaknya.
Karena puncak ini sangat asimetris, yang terbaik adalah mengukur lebarnya sedekat mungkin dengan garis dasar untuk mendapatkan ukuran penyebaran pita ekstra kolom yang baik. Misalnya lebar puncak pada 4,4 % tinggi puncak setara dengan lebar 5 standar deviasi.
