HPLC merupakan instrument alat yang wajib ada di industri farmasi karena hampir semua pemeriksaan bahan (baik bahan baku maupun produk jadi) menggunakan alat ini. Dalam bahasa Indonesia disebut Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Pengujian di HPLC merupakan pengujian dengan instrument yang paling banyak disebut dalam Farmakope Indonesia VI. HPLC ini adalah teknik kimia analitik yang digunakan untuk memisahkan, mengukur dan mengidentifikasi setiap komponen yang ada dalam campuran. Teknik ini tergantung pada pompa untuk mendorong beberapa pelarut cair kendala yang berisi campuran sampel melalui kolom yang berisi bahan penyerap padat.
Pengertian HPLC
HPLC atau High Performance Liquid Chromatography adalah sebuah instrumen yang menggunakan prinsip kromatografi (pemisahan) dengan menggunakan fase gerak cair yang dialirkan melalui kolom yang merupakan fase diam menuju ke detektor dengan bantuan pompa. Sampel dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikan.
Sampel setelah disuntukkan akan didorong kemudian terjadi pemisahan komponen senyawa di dalam kolom HPLC, komponen akan terpisah sesuai dengan kepolaran yang berbeda-beda tergantung kekuatan interaksi antara komponen dengan kolo,. Senyawa komponen yang interaksinya kuat dengan fase diam akan keluar belakangan dibandingkan dengan yang interaksinya lemah. Senyawa yang keluar dari kolom HPLC akan dideteksi dengan detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Dari hasil kromatogram akan dicek waktu retensi dan luas area dari puncak yang dihaislkan. Informasi waktu retensi dan luas area kromatogram digunakan untuk menghitung kadar senyawa.
Di industri farmasi, HPLC banyak digunakan dalam proses produksi produk biologi (vaksin) dan juga obat farmasi. Dalam farmasi suplement, digunakan dalam mendeteksi tingkat vitamin D dalam serum darah. Dalam hal penelitian, HPLC digunakan untuk beberapa tujuan. Contoh adalah; memisahkan komponen dalam sampel biologis, yang sebagian besar kompleks.
HPLC atau Kromatografi Cair Kinerja Tinggi digunakan untuk memisahkan dan memurnikan senyawa menurut polaritasnya. Untuk memahami polaritas, kita dapat menggunakan contoh sederhana dari minyak, air dan etanol. Etanol bersifat polar. Dengan demikian akan bercampur dengan baik dengan air. Sebaliknya, minyak tidak bersifat polar, sehingga tidak bercampur dengan baik dengan air.
Kolom HPLC juga disebut fase diam. Kolom terbuat dari zat yang berbeda, kebanyakan silika, dan sangat padat di alam. Rantai karbon panjang memfungsikan partikel silika. Rantai karbon bersifat non-polar. Jadi, semakin panjang rantainya, semakin non-polar kolomnya. Kolom C18 adalah yang paling banyak digunakan dan mengandung 18 rantai karbon.
Senyawa disuntikkan ke dalam kolom HPLC. Fase gerak, yang merupakan campuran air dan pelarut organik kemudian dimasukkan. Pelarut organik yang digunakan kebanyakan metanol atau asetonitril. Ini disebut fase gerak karena campuran bergerak melalui kolom HPLC dan masih mengeluarkan senyawa dalam kolom pada saat yang bersamaan. Proses pembilasan juga dikenal sebagai eluting.
Senyawa sering dielusi bersama Elusi gradien konsentrasi. Elusi gradien proses pemisahan dengan komposisi pelarut berbeda.Misalnya ingin memisahkan zat B dan C (sifat kepolarannya mirip) dari sampel. Menggunakan komposisi pelarut pada 5 menit pertama, air saja (100). Lalu pada 5 menit selanjutnya, menggunakan campuran air dan metanol (60:40). Lalu menit selanjutnya hingga akhir pemisahan, menggunakan pelarut metanol saja (100).
Dalam istilah yang lebih sederhana, jumlah air yang berada dalam fase gerak berkurang setelah beberapa waktu, karena persentase pelarut non-polar meningkat secara serempak. Komponen dalam fase gerak kemudian akan menjadi lebih non-polar. Senyawa-senyawa yang terdapat pada sampel yang digunakan akan menempel pada rantai karbon pada kolom. Senyawa yang paling non-polar akan menempel paling kuat sedangkan senyawa yang paling polar akan menempel lemah.
Elusi isokratik adalah proses pemisahan dengan menggunakan komposisi pelarut yang sama. Misalnya ingin memisahkan zat A pada suatu sampel, hanya menggunakan air dan metanol dengan perbandingan tetap (80:20) hingga proses pemisahan selesai. Sedangkan elusi gradien proses pemisahan dengan komposisi pelarut berbeda.
Pada dasarnya, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi memisahkan komponen dari senyawanya sesuai dengan polaritasnya. HPLC juga digunakan sebagai alat analisis untuk memeriksa sampel lingkungan dan biologis untuk ada atau bahkan tidak adanya senyawa yang diketahui. Senyawa tersebut termasuk obat-obatan, racun, dan pestisida. Ini juga dapat membantu dalam identifikasi senyawa yang tidak diketahui.
harga instrument HPLC ini sepengalaman saya cukup mahal diatas 500 juta rupiah sampai dengan 1 milyar rupiah. Oleh karena itu pemilihan harus dilakukan dengan cermat dengan menyusun URS dan kualifikasi desain yang tepat. Instument HPLC juga harus dibeli seuai dengan kebutuhan pemeriksaan dan sesuai dengan tuntutan regulasi terbaru semisal validasi sistem komputer serta integritas data. Kalibrasi juga wajib ada waktu pembelian HPLC. Dokumen kualifikasi intalasi dan kualifikasi operasi juga harus lengkap.
Selain itu dukungan pemeliharaan juga harus bagus dan cepat. Sepengalaman saya ada vendor HPLC yang pemeliharaan cepat dan gratis tapi secara unit HPLC lebih murah dan sebaliknya HPLC mahal tapi pemeliharaan juga mahal dan sekali datang teknisi dibebankan biaya (dan belum tentu berhasil perbaikan HPLCnya)
Semoga Bermafaat
Salam
M. Fithrul Mubarok, M. Farm.,Apt
