Spektrofotometer – Pengertian, Jenis, Bagian dan Prinsip Kerjanya

Pengertian

Spektrofotometer adalah alat laboratorium yang digunakan untuk menganalisa kadar senyawa, alat ini menggunakan teknik spektroskopi yaitu dengan emisi radiasi suatu senyawa.

Spektrofotometer hampir selalu ada di semua lab farmasi dan kimia.

Spektrofotometer adalah alat yang terdiri dari spectrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan foto meter adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi.

Alat ini bersama dengan HPLC sering digunakan untuk mengukur kadar senyawa obat. Alat ini dipasang juga pada HPLC sebagai detektor untuk mengetahui kadar senyawa yang telah dielusi oleh HPLC.

Spektrofotometer terdiri dari dua alat yaitu spektrometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer alat untuk mengukur intensitas cahaya yang diabsobrsi. Ilmu spektrofotometri merupakan salah satu metode analisis kuantitatif yang penggunaanya sangat luas seperti kimia, fisika, biokimia, teknik material, teknik kimia dan penggunaan klinis.

Spektrofotometri adalah metode untuk mengukur berapa banyak substansi kimia, ini diukur dengan mengukur banyaknya absorbsi dari cahaya yang dilewatkan pada sampel larutan. Cahaya yang dilewatkan disebut juga beam. Cahaya ini dilewatkan dengan panjang gelombang (lamda) tertentu.

Keuntungan utama metode spektrofotometri adalah metode ini memberikan cara sederhana untuk menetapkan kuantitas zat yang kecil. Selain itu, hasil yangdiperoleh cukup akurat, dimana angka yang terbaca langsung dicatat oleh detektor dan tercetak dalam bentuk angka digital ataupun grafik yang sudah diregresikan.

Prinsip Kerja Spektrofotometer

Setiap komponen kimia bersifat mengabsorbsi cahaya, atau memantulkan cahaya (bisa juga radiasi elektromagnetik) pada panjang gelombang tertentu. Nilai absorbansi dari cahaya yang diserap sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet. Jadi larutan dimasukkan ke dalam kuvet, cahaya dilewatkan ke dalam kuvet. Kuvet ini biasanya terbuat dari kaca dengan sifat sedikit mengabsorbsi cahaya. Kuvet terbuat dari kaca kuarsa yang sedikit mengabsorbsi cahaya. Kuvet yang terbuat dari bahan kuarsa mempunyai kualitas yang lebih baik dari pada kuvet yang terbuat dari gelas. Kualitas kuvet dilihat dari banyak sedikitnya sinar yang diserap oleh kuvet tersebut. Semakin sedikit sinar yang diserap oleh kuvet tersebut. Kualitas kuvet semakin baik. Kuvet harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut: Tidak berwarna sehingga dapat mentransmisikan semua cahaya. Permukaannya secara optis harus benar-benar sejajar.

Kuvet ini harganya sangat mahal dan mudah pecah sehingga pengunaanya dalam spektrofotometer perlu sangat hati-hati.

Terdapat berbagai variasi spektrofotometri seperti spektrofotometri absorbsi atom dan spektrofotometri emisi atom. Spektrofotometer adalah instrument alat yang mengukur jumlah foton (intensitas cahaya) yang terabsorbsi setelah melewati sampel cairan di dalam kuvet. Dengan spektrofotometer konsentrasi kimia larutan dapat ditentukan dengan mengukur intensitas cahaya yang terdeteksi.

Skematik Alur Kerja Spektrofotometer

Cahaya yang berasal dari lampu diteruskan melalui lensa menuju ke monokromator, kemudian cahaya akan diubah cahaya yang awalnya polikromatis menjadi cahaya monokromatis (tunggal). Berkas cahaya dilewatkan pada sampel yang mengandung zat konsentrasi dengan tertentu. Cahaya yang terbentuk ada yang diserap (diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan. Cahaya yang dilewatkan kemudian diterima oleh detektor. Cahaya yang diterima dihitung dan untuk mengetahui cahaya yang diserap sampel. Cahaya yang diserap sebanding dengan konsentrasi zat yang terkandung dalam sampel, sehingga akan diketahui konsentrasi zat dalam sampel secara kuantitatif. Berikut skemanya:

Jenis Spektrofotometer Berdasarkan Sumber Cahaya

Berdasarkan range/kisaran dari panjang gelombang dari sumber cahaya, dapat dibedakan menjadi :

• Spektrofotometer UV-Visible adalah menggunakan cahaya dengan kisaran ultraviolet (185-400 nm) dan kisaran cahaya visible (terlihat) (400-700 nm). Spektrofotometri UV-Vis merupakan salah satu teknik analisis spektroskopi yang memakai sumber radiasi eleltromagnetik ultraviolet dekat (185-400 nm) dan sinar tampak (400-700 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. Spektrofotometri UV-Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif ketimbang kualitatif.
• Spektrofotometer IR (infra Red) adalah menggunakan cahaya pada kisaran (700-15000 nm). Spektrofotometri Infra Red adalah pengukuran dari interaksi dari radiasi infra red dengan material yang diabsorbsi, diemisikan atau refleksi. Spektrofotometer infra red digunakan secara luas untuk identifikasi subtansi kimia atau grup fungsional pada padatan, cairan atau gas.

Pada spektrofotometer visible, absorbsi dan trasnmisi dari subtansi kimia dapat ditentukan dengan warnanya. Misalnya, larutan yang mengabsorbsi cahaya pada kisaran cahaya visible akan terlihat hitam dan jika semua terlewati maka terlihat putih.

Jenis Spektrofotometer Berdasarkan Kelasnya

Terdapat dua kelas spektrofotometer yaitu single (tunggal) beam dan double (ganda) beam.

• Single Beam
  Pada spektrofotometer single beam, komponen disusun tunggal, pada jenis ini lebih murah dan lebih mudah pemeliharaannya. Pada spektrofotometer single beam dibutuhkan standar referensi untuk mengukur internsitas cahaya sebelum dan sesudah sampel dimasukkan.
• Double Beam
  Pada spektrofotometer double beam, sumber cahaya dibagi menjadi dua berkas cahaya setelah melewati monokrometor. Berkas cahaya yang satu digunakan untuk sampel dan berkas cahaya lainnya digunakan untuk reference standar. Konfigurasi double beam ini sangat menguntungkan karena pembacaan sampel dan standar dapat dilakukan simultan (bersamaan) sehingga pengukuran menjadi independen dari variasi intensitas sumber cahaya.

Bagian-bagian dari Spektrofotometer

• Sumber cahaya
  Sumber cahaya yang sering digunakan adalah lampu wolfram, yang mempunyai keunggulan energi radiasi tidak bervariasi pada berbagai panjang gelombang. Pada spektrofotometer UV-Visible biasanya digunakan lampu deuterium dan lampu tungsten halogen.
• Monokromator
  Monokromator alat yang berfungsi menguraikan cahaya polikromatis menjadi beberapa panjang gelombang yang berbeda-beda (monokromatis). Biasanya penguraian cahaya ini menggunakan sebuah prisma untuk mendifraksi cahaya.
  

• Kuvet
  Kuvet terbuat dari kaca kuarsa yang sedikit mengabsorbsi cahaya. Kuvet yang terbuat dari bahan kuarsa mempunyai kualitas yang lebih baik dari pada kuvet yang terbuat dari gelas. Kuvet merupakan alat yang digunakan untuk mengukur konsentrasi reagen yang dibaca pada spektrofotometer. Berbagai jenis bahan kuvet yang sering digunakan di laboratorium yaitu kuvet gelas dan kuvet plastik. Kuvet gelas adalah kuvet yang terbuat dari kaca dan dapat digunakan berulang-ulang, namun pada pengukuran di daerah UV hanya dapat digunakan kuvet yang terbuat dari bahan kuarsa, karena kuvet yang terbuat dari kaca tidak dapat mengabsorbsi sinar UV sehingga tidak dapat digunakan pada saat pengukuran di daerah UV

• Detektor
  Detektor spektrofotometer mengubah cahaya menjadi sinyal listrik yang besarnya sebanding dengan intensitas cahaya. Peranan detektor penerma adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi sinyal listrik yang selanjutnya akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk jarum atau angka digital.

Syarat detektor yang baik diantaranya:

• Kepekaan yang tinggi terhadap radiasi yang diteriama, dengan derau yang minimal.
• Mampu memberikan respon     terhadap radiasi     pada rentang   panjang gelombang yang lebar (UV-Vis).
• Respon terhadap radiasi harus serempak.
• Respon  harus kuantitatif dan sinyal elektronik yang keluar berbanding lurus dengan radiasi elektromagnetik yang diterima.
• Sinyal    elektronik yang dihasilkan harus dapat diamplifikasikan oleh penguat (amplifier) ke rekorder (pencatat).

Hukum Lambert-Beer

Hukum Lambert-Beer menyatakan bahwa terdapat hubungan linear antara absorbansi dan konsentrasi sampel. Dengan alasan ini hukum ini dapat diaplikasikan ketika ada hubungan linear titik-titik konsentrasi versus absorban. Rumusnya adalah sebagai berikut :

A=ϵlc

Dimana

• A adalah nilai absorban (tanpa satuan unit)
• ϵ adalah koefisien molar atau absortivitas molar
• l adalah panajng jalur (satuan cm)
• c adalah konsentrasi

Panjang jalur satuannya adalah centimeter, karena spektrofotometer menggunakan kuvet dengan lebar 1 cm, sehingga l= 1 cm. Absorban dan panjang jalur diketahui maka dapat kita hitung konsentrasi (c) dari sampel.

Contoh perhitungan:

Sampel yang berisi Guanosine  mempunyai absorban maksimum pada panjang gelombang 275 nm. ϵ₂₇₅=8400M⁻¹cm⁻¹ dan panjang jalur 1 cm. Menggunakan spektrofotometer diukur sampel guanoseine tersebut pada panjang gelombang 275 nm didapatkan nilai 0,70 ( A₂₇₅=0,70). Berapa konsentrasi dari sampel Guanosine ?

Jawaban:

Untuk menghitung soal diatas maka gunakan rumus Lambert-Beer.

A=ϵlc

0,70 = (8400 M^-1 cm^-1)x (1 cm) x c

c= 0,7/[(8400 M^-1 cm^-1)(1 cm)]

c = 8,33×10^-5 mol/L

Maka konsentrasi sampel Guanosine (c) adalah 8,33×10^-5 mol/L.

Biasanya dalam praktikum kimia akan dibuat seri larutan sampel yang sudah diketahui konsentrasinya. Masing-masing larutan sampel dengan konsentrasi tertentu diukur absorbansinya dengan spektrofotometer. Akan didapat nilai konsentrasi versus absorban, nilai ini kemudian dibuat regresi linearnya sehingga didapat persamaan yang menghubungkan konsentrasi dengan absorban. Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai konsentrasi. Masing-masing absorbansi dengan berbagai konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi. Misalnya sebagai berikut :

Dibuat regresi linear antara konsentrasi versus absorban diatas dapat menggunakan Microsoft Excell atau kalkukator Scientific, didapkan persamaan :

Y = 0,24507X + 0,02973

dengan R adalah 0,998.

Berikut grafiknya:

Setahu saya nilai absorbansi yang baik (Y) berada pada rentang 0,2-0,8 diluar rentang tersebut hukum labert-beert sudah tidak linear lagi.

Note :

Perhitungan diatas saya menggunakan online calculator disini.

Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan  respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima.

Brand Spektrofotometer

Di pasaran terdapat bermacam-macam merk brand Spektrofotometer seperti Hitachi, Shimadzu, Agilent, thermofischer dan lain-lain. Berikut contoh merk spektrofotometer dan tipenya :

• UV-Vis-NIR Spectrophotometer UV-3600 Plus – Shimadzu.
• NanoDrop™ 2000/c Spectrophotometer – Thermo Fisher Scientific.
• Cary 6000i UV-Vis-NIR Spectrophotometer – Agilent Technologies.
• LAMBDA 25, 35, & 45 UV/Vis Spectrophotometers – PerkinElmer.
• DR 6000™ UV-Vis Spectrophotometer – Hach Technology.

Referensi:

• https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Physical_and_Theoretical_Chemistry_Textbook_Maps/Supplemental_Modules_(Physical_and_Theoretical_Chemistry)/Kinetics/02%3A_Reaction_Rates/2.01%3A_Experimental_Determination_of_Kinetics/2.1.05%3A_Spectrophotometry#:~:text=A%20spectrophotometer%20is%20an%20instrument,the%20intensity%20of%20light%20detected.
• http://repository.unimus.ac.id/3183/4/BAB-II.pdf

Semoga Bermanfaat

Salam

M. Fithrul Mubarok, M. Farm.,Apt