Pengertian HPLC
HPLC adalah kepanjangan High-performance liquid chromatography atau kadang disebut High-pressure liquid chromatography (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi/KCKT) adalah sebuah teknik analisis untuk identifikasi zat/senyawa dan memisahkan serta mengukur jumlahnya dalam suatu larutan campuran. HPLC ini sering digunakan pada laboratorium kimia (quality control), makanan, limbah, biologi maupun farmasi. Di industri farmasi sendiri hampir pasti ada unit HPLC yang digunakan untuk menguji kadar bahan baku, bahan antara maupun produk jadi. HPLC merupakan tipe kromatografi kolom yang secara luas digunakan di farmasi. HPLC ini sangat berguna untuk menentukan kadar dan kadar zat terkait pada obat. Secara umum HPLC digunakan untuk memisahkan komponen zat dalam obat.
[adinserter block=”1″]
Keunggulan dan Kekurangan HPLC
Dibandingkan dengan Kromatografi Gas/Gas Chromatography (GC), HPLC mempunyai kelebihan yaitu dapat untuk analisis zat yang tidak menguap (volatile) sedangkan pada gas kromatografi zat yang tidak menguap harus dibuat menguap dahulu baru bisa analisis. Mengubah zat tidak menguap menjadi menguap ini membutuhkan usaha yang tidak mudah agar berhasil. Keuntungan menggunakan HPLC untuk analisis adalah membutuhkan ukuran sampel yang kecil, pengujian dapat dimodifikasi tergantung pada tingkat kuantifikasi yang diperlukan, dan menghasilkan hasil yang andal. Kekurangan HPLC adalah membutuhkan analis/SDM khusus untuk mengoperasikan dikarenakan pengoperasian membutuhkan skill kompetensi khusus. Hal-hal berhubungan dengan HPLC juga mahal-mahal seperti reagen, sparepart dan kolom. Harga kolom HPLC bisa sampai puluhan juta rupiah.
Prinsip Kerja HPLC
HPLC merupakan jenis dari kromatografi kolom dan bekerja dengan prinsip yang sama. Prinsip utama dari kromatografi kolom adalah adanya adsorbsi (penempelan permukaan) dari solut (cairan sampel) ke dalam larutan melalui fase diam yang menyebabkan adanya pemisahan solut dengan larutan. Tingkat adsorbsi tergantung pada afinitas dari fase diam dan fase gerak. Fase diam terdiri dari adsorben seperti silika.
HPLC berfungsi sama dengan prinsip kromatografi diatas. Campuran sampel atau analit yang terlarut dalam cairan larutan dipompa. Ini akan menjadi fase geraknya, jadi analit masuk ke dalam fase gerak. Larutan fase gerak ini karena dipompa maka bergerak melewati fase diam dengan tekanan yang tinggi. Fase diam terdiri dari kolom atau disebut juga kolom HPLC. Ketika sampel dilewatkan pada kolom maka akan berinteraksi dengan dua fase tersebut (fase diam dan fase gerak).
Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit berdasarkan kepolarannya, setiap campuran yang keluar akan terdeteksi dengan detektor dan direkam dalam bentuk kromatogram. Dimana jumlah peak menyatakan jumlah komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran.
Interkasi analait pada fase diam dan fase gerak menyebabkan pemisahan. Pemisahan ini didorong oleh kekuatan interaksi dan kepolaran. Bila analit lebih polar dia akan menempel ke fase yang lebih polar, bila fase diam lebih polar maka analit akan banyak menempel di dase diam. Akhirnya akan menciptakan pemisahan-pemisahan fase. Deteksi menggunakan detektor (UV-VIS) akan mengenali pemisahan analit ini setelah melewati kolom HPLC. SIgnal akan dikonversi dan direkam oleh komputer dan ditunjukkan menjadi kromatogram.
Fase gerak biasanya adalah campran air, asetonitril dan metanol. Berbagai komponen campuran berinteraksi pada berbagai tingkatan karena interaksi fase diam dan gerak.
Bagian-bagian dari HPLC
Umumnya HPLC terdiri dari bagian-bagian berikut :
- Penampung solven
untuk menampung solven sebagai fase gerak - Pompa
Mendorong solven dan analit melewati kolom dengan tekanan tinggi - Valve injeksi
Tempat memasukkan analit ke dalam HPLC - kolom
Sebagai fase diam, berperan dalam pemisahan analit - detektor
Mendeteksi jumlah analit dengan detektor UV Vis - Unit pemroses data
memproses hasil deteksi analit, flow, tekanan dan lain untuk disajikan dalam laporan
Tipe Kolom HPLC
Kolom merupakan komponen utama dalam HPLC karena kolom bertanggung jawab dalam pemisahan sampel. Sampel melewati kolom dengan fase gerak dan memisahkan komponennya selama keluar dari kolom. Secara umum kolom terbuat dari silika gel yang dimampatkan. Silika gel dipiliha karena ukuran partikel dan porositasnya tepat dapat memisahkan komponen. Selain itu silika gel bersifat inert (tidak beraksi) dengan fase gerak.
Kolom HPLC dapat dibedakan berdasarkan senyawa penyusun fase diamnya. Kolom yang paling umum adalah tipe C18. Kolom tipe C18 adalah kolom HPLC (kromatografi cair kinerja tinggi) yang menggunakan bahan C18 sebagai fase diam. Kolom HPLC C18 digunakan dalam ilmu lingkungan dan analisis kimia, serta industri seperti ilmu farmasi dan lingkungan, untuk menganalisis bagian individu dari campuran bahan kimia. Panjang kolom ada yang 15 cm ada juga yang 25 cm, panjang kolom ini menentukan lama dari analisisnya/elusinya. ODS dan BDS adalah dua kolom yang digunakan untuk kromatografi fase terbalik. Perbedaan utama antara kolom ODS dan BDS adalah kolom ODS berisi gugus fungsi -OH bebas, sedangkan kolom BDS berisi gugus -OH yang dinonaktifkan. Selain itu, kolom ODS memiliki tailing puncak yang tinggi sedangkan kolom BDS dirancang untuk mengurangi tailing puncak
Perbedaan Kolom HPLC C8 vs C18
Kolom C18 HPLC merupakan kolom yang biasa umum digunakan untuk analisis HPLC. C8 dan C18 menunjuk pada rantai alkil dalam kolom HPLC. Kedua kolom mempunyai persamaan juga perbedaan. C18 mempunyai jumlah atom karbon 18 disebut juga Octadecylsilane dan C8 hanya mempunyai 8 atom (octylsilane). Kolom C18 cenderung menahan lebih lama daripada C8. Jika sampel yang sama dielusi pada kolom C8 dan C18 maka akan terelusi lebih cepat pada C8 dibandingkan pada C18.
Kolom C18 lebih rapat dibandingkan dengan kolom C8. Kerapatan ini akan meningkatkan area permukaan sehingga fase gerak lebih banyak kontak dengan kolom C18. Permukaan yang lebih luas pada kolom C18 akan meningkatkan interaksi antara eluen dengan fase diam sehingga pemisahan akan lebih bagus.
Kolom C18 karena mempunyai jumlah karbon lebih banyak dibandingkan dengan kolom C8 maka sifatnya lebih hidrofobik dan menaham komponen non polar lebih lama. Kolom C18 lebih baik memisahkan komponen dibandingkan kolom C8 dalam memisahkan asam lemak yang panjang.
Tipe-tipe HPLC
Tipe HPLC dapat dibedakan berdasarkan dengan fase diamnya yaitu HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
- HPLC Fase Normal
Dasar pemisahan dalam HPLC ini adalah polaritas dari fase diam dan gerak. HPLC fase normal berarti menggunakan fase diam polar dan menggunakan fase gerak non polar. Fase diam biasanya adalah silika dan fase gerak dapat berupa kloroform, dietil eter, heksan atau kombinasi dari semua itu. Berikut skematik dari HPLC fase normal.
2. HPLC Fase Terbalik
Di HPLC fase terbalik, fase diamnya adalah non polar dan fase geraknya polar. Prinsip kerjanya adalah interkasi hidrofobik dari molekul. Dalam tipe HPLC ini material non polar tertahan daripada material polar. Berikut gambaran skematik HPLC fase terbalik.
3. HPLC Pertukaran Ion
Komponen yang mudah terionisasi dianalisis menggunakan kolom pertukaran ion. Fase diam pada kolom ini bersifat asam atau basa dengan mempunyai tegangan positif atau negatif. Fase gerak larutan polar dalam bentuk lautan garam dalam air. Pemisahan molekul terjadi karena persamaan/perbedaan kekuatan ion antara sampel dengan fase diam.
4. Size Exclusion HPLC
Fase diam kolom sangat porous membantu pemisahahan sampel berdasarkan ukurannya. Kolom terbuat dari kombinasi polimer seperti sakarida dan silika juga digunakan untuk fase diam kolom ini. Sampel dengan ukuran besar akan terelusi keluar duluan kemudian ukuran molekul kecil keluar belakangan. Tipe kolom ini tidak digunakan untuk analisis sediaan farmasi.
Penggunaan HPLC
Penggunaan HPLC sangat luas sekali mulai dari untuk penelitian dan industri. HPLC digunakan baik pada analisis kualitatif dan kuantitatif. Fase HPLC normal lebih jarang digunakan dan HPLC fase terbalik lebih sering digunakan karena lebih banyak memisahkan berbagai jenis sampel. HPLC dapat digunakan padaberbagai aplikasi seperti penetuan berat molekul, pemeriksaan kadar, uji klinis, forensi, analisis makanan, kimia lingkungan dan kimia analisis.
Tipe Elusi
Terdapat dua tipe elusi yaitu gradient dan tipe elusi isokratik.
Tipe Elusi Gradien:
Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi). Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak selama suatu analisis kromatografi berlangsung. Digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. Pengaruh yang menguntungkan dari elusi gradien adalah memperpendek waktu analisis senyawa-senyawa yang secara kuat ditahan di dalam kolom.
Tipe Elusi Isokratik:
Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fase gerak tetap selama elusi).
Istilah-istilah dalam HPLC
- Parameter kromatografik
Setelah dilakukan elusi detektor akan mendeteksi kemudian diterjemahkan dalam kromatogram. Tiap puncak pada kromatogram mengandung informasi analit baik kuantitatif dan kualitatif. Semakin besar area dibawah kurva (AUC, Area under curve) maka semakin besar kadar analit. - Waktu Retensi (tr)
Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan suatu zat mulai dari injeksi sampai terdeteksi oleh detektor. Waktu retensi menunjukkan interaksi kuat tidaknya antara fase diam dan fase gerak. Waktu retensi tiap zat spesifik untuk masing-masing zat dengan catatan kondisinya sama. - Lebar Puncak (w)
Lebar puncak mencakup periode dari awal kemiringan sinyal hingga mencapai garis dasar setelah penurunan berulang dalam sinyal detektor. - Tailing Factor
Dalam HPLC puncak yang sempurna simetris jarang terjadi selalu ada puncak kecil di belakang yang disebut tailing. Puncak dari tailing diukur menggunakan tailing factor T. Rumus tailing factor adalah T=b/a. - Waktu Delay (t0)
Waktu tunda mengacu pada waktu yang diperlukan untuk senyawa tidak terbelakang untuk diangkut dari tempat injeksi ke unit detektor (dimana senyawa tersebut direkam). Selama waktu ini, semua molekul sampel secara eksklusif berada di fase gerak. Secara umum, semua molekul sampel memiliki penundaan yang sama waktu. Pemisahan tersebut disebabkan oleh perbedaan kelekatan zat dengan fase diam. - Standar Internal : Standar internal dalam kimia analitik HPLC adalah bahan kimia yang ditambahkan dalam jumlah konstan ke sampel, blanko, dan standar kalibrasi dalam analisis kimia. Zat ini kemudian dapat digunakan untuk kalibrasi dengan memplot rasio sinyal analit ke sinyal standar internal sebagai fungsi dari konsentrasi analit standar. Fungsi standar internal adalah menetukan konsentrasi analit laindengan menghitung faktor respon.
Brand HPLC
Kebanyakan brand HPLC yang digunakan merupakan merk dari negara-negara maju seperti Jerman, Amerika Serikat dan Jepang. HPLC yang terkenal adalah HPLC Shimadzu, Agilent, Thermoscientific dan Waters.
Referensi :
https://blog.biomall.in/hplc-high-performance-liquid-chromatography/
https://www.knauer.net/Application/application_notes/VSP0019_HPLC%20Basics%20-%20principles%20and%20parameters_final%20-web-.pdf
