Bagaimana cara membuat kolom HPLC bertahan lebih lama?
Berapa lama kolom HPLC atau UHPLC dapat bertahan?
Masa pakai kolom bergantung pada cara penggunaannya dan seberapa baik pemeliharaannya. Kolom C18 atau C18 berair umumnya bertahan paling lama, sedangkan fase amino biasanya memiliki masa pakai terpendek.
Meskipun biaya relatif kolom kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) telah berkurang seiring berjalannya waktu, perpanjangan masa pakai kolom tetap menjadi pertimbangan penting bagi sebagian besar laboratorium. Kiat-kiat berikut akan membantu melindungi kolom Anda dan secara signifikan memperpanjang masa manfaat sebagian besar fase.
- Selalu baca literatur pabrikan mengenai tekanan yang direkomendasikan, pH eluen, dan rentang pengoperasian suhu untuk kolom, dan patuhi rentang tersebut.
- Hindari guncangan mekanis pada dasar kolom (kolom terjatuh) dan tingkatkan tekanan dan aliran secara perlahan (idealnya 1 mL/menit/menit) setiap kali aliran eluen dimulai.
- Jika kolom telah mengering, mulailah aliran dengan sangat lambat (0,1 mL/menit/menit) menggunakan eluen yang mengandung setidaknya 50% asetonitril.
- Jika sampel kemungkinan besar mengandung partikel, pilihlah filter inline berkualitas baik dengan ukuran mata jaring yang sesuai; Biasanya 0,45 μm untuk kolom tradisional dan 0,2 μm untuk kolom UHPLC
- Kolom harus dicuci dengan benar setelah digunakan.
- Jika kontaminasi kolom atau frit dicurigai sebagai akibat dari pemisahan puncak atau hilangnya efisiensi, maka dimungkinkan untuk membalikkan arah kolom untuk tujuan pembilasan balik, dan prosedur pencucian kolom yang disebutkan di atas adalah “resep” yang baik untuk ini. tujuan.
Berikut adalah pembunuh kolom LC yang paling umum:
Partikulat
Ini biasanya berasal dari matriks sampel tanpa filter, namun bisa juga berasal dari fase gerak tanpa filter.
Bahan reaktif dalam sampel
Yang paling jelas adalah agen derivatisasi, tetapi bisa juga berasal dari matriks sampel. Kecuali Anda memiliki informasi rinci tentang matriks sampel Anda, kemungkinan besar terdapat komponen yang tidak terduga dan tidak memiliki karakter. Hal ini bahkan dapat terdapat pada matriks yang tampak cukup bersih, seperti urin.
Kondisi pH yang keras:
Kisaran pengoperasian yang disarankan untuk kolom kami adalah 2,5-8,0. PH yang terlalu rendah dapat menghilangkan fase terikat dari silika, sedangkan pH yang terlalu tinggi akan mulai menghidrolisis silika itu sendiri.
Kondisi fase atau aliran gerak yang tidak kompatibel
Perlu diketahui bahwa hanya fase tertentu yang dirancang untuk digunakan dengan lebih dari 95% air dalam fase gerak. Fase terikat dalam kolom C18 tradisional akan runtuh pada kondisi ini. (Anda harus menggunakan kolom Aqueous C18 jika memungkinkan.) Ini adalah salah satu contoh kerusakan kolom jenis ini.
Jadi… untuk membantu kolom Anda berumur panjang, Anda harus melakukan hal berikut:
Pastikan laju aliran dan tekanan Anda sesuai dengan dimensi kolom dan ukuran partikel Anda. Berikut adalah tabel berguna dari katalog kami saat ini:
Laju Aliran Optimal untuk berbagai diameter partikel dan diameter internal kolom.
Jika Anda baru saja mengurangi ID kolom, pastikan Anda mengurangi laju aliran sesuai kebutuhan. Sejauh tekanan berjalan, secara umum, yang terbaik adalah tetap di bawah a
tekanan balik 5000 psi untuk HPLC dan di bawah 12000 psi untuk UHPLC (ukuran partikel di bawah 3 um).
Pra-filter semua sampel sebelum injeksi LC, baik dengan menggunakan filter jarum suntik atau botol filter Thomson Single Step.
Jika volume sampel terlalu rendah untuk salah satu opsi di atas, pastikan Anda menggunakan tutup frit dengan kartrid pelindung Anda.
Jika melakukan UHPLC, Anda harus menggunakan salah satu filter inline kami, baik Filter Prakolom UHPLC UltraShield atau Filter Inline Ultra UHPLC.
- Gunakan kartrid pelindung untuk HPLC untuk meminimalkan kerusakan akibat bahan reaktif dan adsorpsi. Jika Anda pernah mengalami masalah dengan masa pakai kolom yang pendek, kartrid yang lebih panjang mungkin bisa membantu.
Panjang 20 mm harus digunakan untuk sampel apa pun yang berpotensi mengandung komponen reaktif atau komponen yang sangat teradsorpsi. - Pra-filter fase gerak jika mengandung garam penyangga atau pengubah apa pun yang berasal dari penimbangan bahan padat. Selain itu, pastikan Anda menggunakan pelarut dengan kualitas HPLC atau lebih baik.
Jika menggunakan buffer dalam fase gerak Anda, jangan membuat perubahan drastis dari kandungan air tinggi ke rendah saat memompa kolom Anda. Jika tujuan Anda adalah beralih ke pelarut organik 100%, pastikan Anda membilas buffer terlebih dahulu menggunakan campuran yang mengandung minimal 50% air untuk minimal 7 volume kolom. Kegagalan untuk melakukan hal ini dapat mengakibatkan garam keluar dari larutan, menyumbat frit dan meningkatkan tekanan balik.
Simpan kolom Anda dalam pelarut yang sesuai Saat menyimpan untuk jangka waktu yang lebih lama (lebih dari 2 hari), yang terbaik adalah selalu membaca petunjuk penanganan kolom untuk kolom tertentu. Kebanyakan kolom fase terbalik (termasuk C18, C18 berair, dan IBD) paling baik disimpan dalam campuran metanol atau asetonitril dan tidak lebih dari 50% air. Beberapa fase kami, seperti bifenil, Propil PFP, dan Amino lebih baik disimpan dalam asetonitril 100%. Hindari fase gerak yang tidak kompatibel, perhatikan bahan yang diketahui reaktif terhadap fase tertentu. Ini termasuk:
- Aldehida dan keton dengan fase amino (termasuk aseton!)
- Senyawa yang mengandung belerang dengan fasa propil PFP
- Persentase yang signifikan dan/atau jumlah air yang tidak konsisten dengan silika telanjang
. Periksa pH sampel Anda (dan fase gerak jika asam atau basa digunakan). Kebanyakan analis menggunakan pengukur pH. Jika Anda menggunakan pengukur, pastikan pengukur tersebut dikalibrasi dengan benar dan sering.
Jagalah kebersihan. Jika biasanya menjalankan gradien untuk fase balik LC, sesekali siram dengan fase gerak yang mengandung air sedikit lebih banyak daripada kondisi awal Anda dan tanpa garam penyangga, jangan melebihi 90% air untuk fase C18 tradisional. Demikian pula, pastikan Anda sesekali menyiram dengan fase gerak yang mengandung sedikit lebih banyak bahan organik daripada yang biasa Anda gunakan. Misalnya, jika gradien Anda naik hingga 90% organik, sesekali siram dengan 95% organik. Sekitar 7 volume kolom untuk masing-masingnya, dilakukan seminggu sekali atau lebih, sudah cukup untuk melakukan hal ini. (Anda mungkin akan melakukan beberapa hal ini sebelum penyimpanan, namun tidak ada salahnya untuk menyebutkannya!) Anda mungkin menemukan bahwa salah satu dari dua prosedur ini lebih bermanfaat daripada yang lain, tergantung pada apa yang ada dalam sampel Anda yang cenderung untuk menetap atau diserap. Anda dapat mengubah pemeliharaan sesuai kebutuhan sesuai dengan ini. Anda dapat mempertimbangkan untuk memprogram siklus pembilasan (dengan gradien yang menjaga konsentrasi pada titik tertinggi dan terendah) di penghujung hari atau secara berkala jika dirasa membantu.
