Pentingnya kolom HPLC
Kolom HPLC merupakan komponen utama dalam HPLC, perawatan kolom HPLC menjadi sangat penting agar mencegah dari kerusakan.
Penggunaan rutin filter in-line dan/atau kartrid pelindung sangat disarankan untuk melindungi kolom HPLC dari penyumbatan frit dan adsorpsi sampel yang ireversibel. Namun, bahkan dengan penggunaan kartrid pelindung, kolom dapat terkontaminasi oleh komponen sampel yang teradsorpsi kuat dalam jangka waktu tertentu. Hal ini dapat diindikasikan dengan peningkatan tekanan balik yang dihasilkan oleh kolom, peningkatan tekanan balik secara tiba-tiba, hilangnya efisiensi kolom, peningkatan tailing dan shouldering atau bahkan pemisahan puncak.
Perlindungan kolom UHPLC juga dianjurkan dan kartrid pelindung harus digunakan jika tersedia. Kartrid pelindung yang mampu menahan tekanan tinggi yang diperlukan tidak tersedia untuk semua kolom UHPLC pabrikan. Dalam kasus ini, disarankan untuk menggunakan filter prakolom yang dapat beroperasi pada tekanan tinggi.
- Untuk memaksimalkan masa pakai kolom, khususnya dengan kolom UHPLC, tips berikut harus dipertimbangkan: • Gunakan hanya pelarut tingkat UHPLC/HPLC yang sangat murni
- Gunakan fase gerak berair yang baru disiapkan untuk mencegah pertumbuhan bakteri
- Saring semua sampel, standar, dan fase gerak (misalnya filter 0,2 siang)
- Gunakan sistem filter in-line
- Lakukan pembersihan sampel pada sampel yang kotor
Harap dicatat bahwa dalam kasus adsorpsi senyawa ireversibel atau kolom kosong, regenerasi kolom mungkin tidak dapat dilakukan.
Pembilasan Kolom
- Jika terjadi penurunan kinerja kolom atau peningkatan tekanan balik, maka prosedur pembersihan atau regenerasi kolom dapat dilakukan dengan menggunakan serangkaian kombinasi pelarut yang lebih kuat. Sangat disarankan untuk membaca petunjuk ‘Perawatan dan Penggunaan’ yang diberikan oleh produsen sebelum memulai prosedur ini.
Meskipun sebagian besar kolom berukuran partikel 3, 5, dan 10μm dapat dibilas terbalik atau bahkan digunakan dalam arah sebaliknya, beberapa kolom berukuran 3μm hanya dapat dibilas terbalik untuk waktu yang singkat dan tidak boleh digunakan dalam arah sebaliknya setelahnya. Untuk kolom partikel yang tidak beraturan, disarankan untuk membilas dengan arah aliran normal.
Untuk kolom UHPLC (s2μm), petunjuk ‘Perawatan dan Penggunaan’ dari pabriknya harus dikonsultasikan sebelum mempertimbangkan pembilasan kolom secara terbalik. Dalam beberapa kasus, mungkin lebih baik untuk menyiram kolom UHPLC pada arah aliran normal.
Direkomendasikan agar efisiensi kolom diukur sebelum dan sesudah prosedur pembersihan atau penyimpanan jangka panjang, dengan menggunakan kondisi uji kolom yang diberikan pada kromatogram uji pabrikan atau kondisi dari metode yang diikuti. Hal ini memungkinkan efektivitas prosedur pembersihan apa pun dipantau.
Prosedur Pembersihan Kolom
Prosedur umum berikut direkomendasikan untuk regenerasi kinerja kolom.- Putuskan sambungan dan jika perlu balikkan kolom.
- Hubungkan kolom ke pompa, tetapi bukan detektor.
- Ikuti prosedur pembilasan yang sesuai untuk jenis kolom, dengan menggunakan 10-20 volume kolom untuk setiap pelarut (lihat tabel di bawah). Selalu pastikan bahwa pelarut terakhir yang digunakan kompatibel dengan fase gerak.
- Laju aliran tidak boleh melebihi yang ditentukan pada kromatogram QC untuk kolom tertentu, namun sebaiknya dipertahankan pada 25-50% dari laju aliran kerja normal.
| Volume Kolom (ml) | Panjang 50mm | 150mm | 250mm |
|---|---|---|---|
| PENGENAL. | |||
| 2.1mm | 0,17 | 0,52 | 0,87 |
| 3.2mm | 0,4 | 1.2 | 2.0 |
| 4.6mm | 0,83 | 2.5 | 4.2 |
| 10.0mm | 3.9 | 11.8 | 19.6 |
| 21.2mm | 19.3 | 57.8 | 96.3 |
Tabel ini menunjukkan volume kolom HPLC yang berbeda untuk diameter dalam yang berbeda. Volume kolom dihitung dengan rumus:
Tata Cara Pembilasan Berbagai Jenis Kolom
Kolom fase terbalik: (misalnya tipe C18, C8, C4, Phenyl, CN, ‘AQ’)
a) Fase gerak tanpa buffer
b) Metanol
c) Asetonitril
d) Asetonitril/IPA (75:25)
e) IPA
f) Diklorometana
g) Heksana
Dalam banyak kasus, urutan a) hingga e) mungkin cukup. Jika langkah f) atau g) diperlukan, bilas dengan IPA sebelum kembali ke fase gerak.
Jika ion logam dianggap menyebabkan kontaminasi, bilas dengan larutan EDTA 0,05M diikuti dengan air.
Kolom yang telah digunakan dengan reagen pasangan ion sebaiknya digunakan untuk metode tersebut dan disimpan untuk tujuan ini.
Kolom fase normal terikat: (CN, NH2, Diol)
a) Kloroform
b) IPA
c) Metilen klorida
d) Heksana
Kolom penukar anion: (SAX, WAX)
air
b) Metanol c) Kloroform d) Metanol e) Air
Kolom fase terbalik digunakan untuk analisis protein/peptida
a) Fase gerak tanpa buffer
b) Gradien 10-90%B
Di mana
A = 0,1% TFA dalam air
B = 0,1% TFA dalam asetonitril
Kolom pertukaran kation: (SCX, WCX)
a) Air (suntikkan 4x 200μl DMSO saat pembilasan) b) Tetrahidrofuran
Kolom silika tak terikat: (SIL)
a) IPA b) Metanol
c) Etil asetat
Kolom pengecualian ukuran untuk protein
Untuk protein yang ditahan dengan lemah
a) buffer fosfat 0,1M, pH 3
Untuk protein yang tertahan kuat
a) Gradien 100% air menjadi 100% asetonitril selama 60 menit
Kondisi penyimpanan kolom HPLC berbasis silika
Kondisi penyimpanan kolom akan mempengaruhi masa pakainya. Semua buffer, garam dan reagen pasangan ion harus dikeluarkan dari kolom sebelum disimpan.
Idealnya, pelarut penyimpanan harus seperti yang ditunjukkan pada kromatogram uji kolom awal yang disediakan oleh pabrikan.
Sumbat ujung kolom harus dipasang untuk mencegah penguapan pelarut dan selanjutnya mengeringkan tempat pengepakan.
