Kromatografi Lapis Tipis: Prinsip, aplikasi dan Cara Kerja

Apa itu Kromatografi Lapis Tipis (KLT)?

Kromatografi Lapis Tipis adalah metode pemisahan atau identifikasi campuran komponen menjadi komponen individu dengan menggunakan adsorben padat / (cair) yang terbagi halus yang tersebar di atas piring dan cairan sebagai fase gerak.

SUMBER GAMBAR : https://www.biotechreality.com/2024/02/thin-layer-chromatography-tlc-principle-procedure-diagram-and-applications.html

Kromatografi lapis tipis, yang juga dikenal dengan Thin Layer Chromatography (TLC), adalah sebuah teknik kromatografi planar yang digunakan untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Teknik ini melibatkan fasa diam berupa zat padat, seperti silika gel atau alumina, yang dilapisi pada selembar kaca, plastik, atau logam kaku. Fasa geraknya adalah pelarut cair yang mengalir melalui fasa diam dan membawa komponen campuran bersamanya.

Prinsip pemisahan dalam kromatografi lapis tipis didasarkan pada perbedaan sifat fisik dan kimia dari senyawa, seperti kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan) dan kecenderungan molekul untuk menyerap pada fasa diam. Setiap komponen dalam campuran akan bergerak dengan kecepatan yang berbeda, sehingga memungkinkan pemisahan dan identifikasi komponen tersebut.

Kromatografi lapis tipis banyak digunakan dalam berbagai bidang penelitian seperti fitokimia dan biokimia untuk mengidentifikasi komponen-komponen seperti alkaloid, fosfolipid, dan asam amino.

Prinsip Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

• Kromatografi lapis tipis dilakukan pada selembar kaca, plastik, atau aluminium foil, yang dilapisi dengan lapisan tipis bahan adsorben, biasanya silika gel, aluminium oksida (alumina), atau selulosa. Lapisan adsorben ini dikenal sebagai fase stasioner.
• Setelah sampel diaplikasikan pada pelat, pelarut atau campuran pelarut (dikenal sebagai fase gerak) disusun pelat melalui aksi kapiler. Karena analit yang berbeda naik pelat TLC pada tingkat yang berbeda, pemisahan tercapai.
• Dengan demikian didasarkan pada prinsip kromatografi adsorpsi atau kromatografi partisi atau kombinasi keduanya, tergantung pada adsorben, perlakuannya dan sifat pelarut yang digunakan. Komponen dengan afinitas lebih terhadap fase stasioner bergerak lebih lambat. Komponen dengan afinitas kurang terhadap fase stasioner bergerak lebih cepat.
• Setelah pemisahan terjadi, masing-masing komponen divisualisasikan sebagai bintik-bintik pada tingkat perjalanan masing-masing di pelat. Sifat atau karakter mereka diidentifikasi dengan menggunakan teknik deteksi yang sesuai.

Komponen Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Komponen sistem TLC terdiri dari:

1. Pelat TLC, sebaiknya siap dibuat dengan fase stasioner: Ini adalah pelat yang stabil dan lembam secara kimiawi, di mana lapisan tipis fase stasioner diterapkan pada seluruh lapisan permukaannya. Fase diam pada pelat memiliki ketebalan yang seragam dan dalam ukuran partikel halus.
2. Ruang TLC- Ini digunakan untuk pengembangan pelat TLC. Ruang mempertahankan lingkungan yang seragam di dalam untuk pengembangan bintik-bintik yang tepat. Ini juga mencegah penguapan pelarut, dan menjaga proses bebas debu.
3. Fase gerak – Ini terdiri dari campuran pelarut atau pelarut Fase gerak yang digunakan harus bebas partikulat dan kemurnian tertinggi untuk pengembangan bintik-bintik TLC yang tepat. Pelarut yang direkomendasikan secara kimiawi lembam dengan sampel, fase diam.
4. Kertas saring– Ini dibasahi dalam fase gerak, untuk ditempatkan di dalam ruangan. Ini membantu mengembangkan kenaikan seragam dalam fase gerak selama fase stasioner.

Prosedur Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Fase diam diterapkan ke pelat secara seragam dan kemudian dibiarkan kering dan stabil. Namun, belakangan ini, piring siap pakai lebih umum digunakan.

1. Dengan pensil, tanda tipis dibuat di bagian bawah piring untuk menerapkan bintik-bintik sampel.
2. Kemudian, larutan sampel diterapkan pada titik-titik yang ditandai pada garis dalam jarak yang sama.
3. Fase gerak dituangkan ke dalam ruang TLC hingga beberapa sentimeter di atas dasar ruang.
4. Kertas saring yang dibasahi dalam fase gerak ditempatkan di dinding bagian dalam ruangan untuk menjaga kelembaban yang sama (dan juga dengan demikian menghindari efek tepi).
5. Sekarang, pelat yang disiapkan dengan bercak sampel ditempatkan di ruang TLC sehingga sisi pelat dengan garis sampel menghadap fase gerak. Kemudian ruang ditutup dengan penutup.
6. Pelat kemudian direndam, sehingga titik sampel jauh di atas tingkat fase gerak (tetapi tidak direndam dalam pelarut) untuk pengembangan.
7. Waktu yang cukup diberikan untuk pengembangan bintik-bintik.
8. Pelat kemudian dilepas dan dibiarkan kering.
9. Bintik-bintik sampel kemudian terlihat di ruang sinar UV yang sesuai, atau metode lain yang direkomendasikan untuk sampel yang diberikan.

Beberapa teknik umum untuk memvisualisasikan hasil pelat TLC meliputi:

1. Sinar UV
2. Pewarnaan Yodium: sangat berguna dalam mendeteksi karbohidrat karena berubah menjadi hitam saat kontak dengan Yodium
3. Pewarnaan KMnO4 (molekul organik)
4. Reagen Ninhidrin: sering digunakan untuk mendeteksi asam amino dan protein

Nilai Faktor Retensi (Rf)

• Perilaku senyawa pada TLC biasanya dijelaskan dalam hal mobilitas relatif atau nilai Rf.
• Rf atau faktor Retensi adalah nilai unik untuk setiap senyawa dalam kondisi yang sama.
• Rf untuk suatu senyawa adalah konstanta dari satu percobaan ke percobaan berikutnya hanya jika kondisi kromatografi di bawah ini juga konstan:
• Sistem pelarut
• adsorben
• ketebalan adsorben
• jumlah material yang terlihat
• suhu
• Karena faktor-faktor ini sulit untuk tetap konstan dari percobaan ke percobaan, nilai Rf relatif umumnya dipertimbangkan.
• Relative Rf” berarti bahwa nilai-nilai dilaporkan relatif terhadap standar.
• Nilai Rf dihitung menggunakan persamaan berikut:

Aplikasi Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

1. Analisis obat-obatan
   Dalam bisnis farmasi, TLC sering digunakan untuk menganalisis molekul kimia, menemukan kontaminan, dan menilai kemurnian obat.

Pengendalian Mutu: Untuk menjamin kepatuhan terhadap persyaratan peraturan, perusahaan farmasi secara teratur menguji bahan mentah, produk antara, dan produk obat jadi menggunakan TLC.

2. Analisis makanan dan minuman
   Bahan tambahan makanan, pengawet, warna, dan rasa pada makanan dan minuman semuanya dianalisis menggunakan TLC. Ini membantu menjamin kepatuhan terhadap aturan dan pedoman keamanan pangan.

Deteksi bahan pemalsuan: TLC membantu memastikan kualitas makanan dan keamanan konsumen dengan membantu mengidentifikasi bahan pemalsuan, polutan, dan racun mikroba dalam sampel makanan dan minuman.

3. Analisis Klinis
   Analisis hormonal: Dalam penelitian klinis dan pengujian diagnostik, TLC digunakan untuk menganalisis hormon, steroid, dan zat endokrin lainnya.

Aplikasi KLT lainnya:

1. Dalam memantau kemajuan reaksi
2. Identifikasi senyawa yang ada dalam campuran yang diberikan
3. Tentukan kemurnian suatu zat.
4. Menganalisis ceramide dan asam lemak
5. Deteksi pestisida atau insektisida dalam makanan dan air
6. Menganalisis komposisi pewarna serat dalam forensik
7. Menguji kemurnian radiokimia radiofarmasi
8. Identifikasi tanaman obat dan konstituennya

Keuntungan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

• KLT adalah proses sederhana dengan waktu pengembangan yang singkat.
• KLT membantu dengan visualisasi bintik-bintik senyawa terpisah dengan mudah.
• KLT membantu dalam mengisolasi sebagian besar senyawa.
• Proses pemisahan lebih cepat dan selektivitas untuk senyawa lebih tinggi (bahkan perbedaan kecil dalam kimia sudah cukup untuk pemisahan yang jelas).
• Standar kemurnian sampel yang diberikan dapat dinilai dengan mudah.
• Ini adalah teknik kromatografi yang lebih murah.

Keterbatasan kromatografi lapis tipis (KLT)

• KLT tidak bisa membedakan antara enansiomer dan beberapa isomer.
• Untuk mengidentifikasi senyawa tertentu, nilai Rf untuk senyawa yang diinginkan harus diketahui sebelumnya.
• Pelat TLC tidak memiliki fase stasioner yang panjang. Oleh karena itu, panjang pemisahan terbatas dibandingkan dengan teknik kromatografi lainnya.