Definisi
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah tipe kromatografi cair yang fase diamnya berupa lapisan tipis sorben partikel yang seragam dalam bentuk pelat gelas, aluminium foil, atau plastik.
Kromatografi lapis tipis termasuk jenis kromatografi planar.
KLT adalah metode kromatografi yang paling sederhana dan murah. Oleh karena itu paling banyak digunakan baik oleh siswa, mahasiswa di perguruan tinggi maupun di lembaga penelitian. Kromatografi planar adalah kromatografi dimana terjadi pemisahan suatu pigmen warna dari suatu klorofil yang di lakukan oleh Tsweet, dimana Tswet mengunakan kolom yang didalamnya dimasukan suatu fase diam yang berupa kalsium karbonat yang disimpan diatasnya suatu ekstrak dari pigment klorofil yang kemudian dielusi dengan suatu pelarut organik, sehingga dihasilkan pemisahan dari pigmen-pigmen tertentu yang terelusi tidak bersamaan, sementara kertas original dari Tsweet berada di Rusia yang dipublikasikan pada tahun 1906, dan di review oleh Ettre.
Dasar Kromatografi Lapis Tipis
Dasar dalam Kromatografi lapis tipis adalah larutan sampel diaplikasikan ke dalam pelat, dan pelat dikembangkan dengan memasukkannya ke dalam bejana tertutup dan bagian dasar dari bejana diisi dengan fase geraknya (eluen) yang biasanya terdiri dari campuran dari beberapa pelarut. Setelah pengembangan, pelat di angkat dari bejana dan ditandai untuk dihitung nilai Rf-nya (jarak pita yang terpisah dan jarak eluennya).
Dengan berbagai optimasi metode pemisahannya dapat dihasilkan pemisahan sampel yang efisien kemudian besaran sampel tersebut dapat dihitung secara akurat. Kromatografi lapis tipis biasanya digunakan untuk memisahkan sampel ekstrak tanaman dan menghitung jumlah (kadar) dalam sampel tersebut. Sampel terdiri dari alkaloid, alkaloid tersebut akan terpisah dalam pelat silika. Praktek pemisahan dengan KLT ini biasanya dilakukan di laboratorium fotokimia.
Beberapa zat harus disinari dengan sinar ultraviolet sehingga lebih mudah dalam pengamatan dan pengukuran.
Prinsip Kerja Kromatografi Lapis Tipis
Prinsip kerja kromatografi lapis tipis adalah pemisahan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran dari sampel versus pelarut fase gerak yang digunakan. Teknik KLT menggunakan fase diam dalam bentuk plat tipis silika dan fase geraknya bisa berupa air atau pelarut organik. Pemilihan fase gerak ini tergantung dengan jenis sampel yang akan dipisahkan.
Eluen merupakan larutan/larutan campuran yang dignakan untuk sebagai fase gerak. Bila sampel semakin mendekati kepolaran eluen maka sampel akan lebih terbawa dan terpisah oleh fase gerak.
Pada dasarnya, pemisahan senyawa-senyawa dalam kromatogram dipengaruhi olehbagaimana kelarutan senyawa dlam pelarut, tergantung pada bagaimana besar antaraksi antaramolekul-molekul senyawa dengan pelarut serta bagaimana senyawa melekat pada fasa diamyang tergantung pada antaraksi aenyawa dengan fasa diam. Dlam proses analisis spot/pemisahanzat, chamber yang berisi eluen dijenuhkan dan ditutup dengan tujuan agar pelarut yangdigunakan tidak menguap, karena hl itu nantinya dpat mempengaruhi proses pemisahan.
Untuk membantu mengidentifikasi zat-zat yang ada dapat dihitung nilai Rf (Retardationfactor) dari masing-masing zat yang ada pada kromatogram. Nilai Rf dapat dihitung denganrumus sebagai berikut :
Rf = (jarak (bercak) bergerak ke atas/jarak permukaan eluen)
Persamaan tersebut dapat dijabarkandengan pendekatan sebagai berikut: Menurut Cremer dan Muller, jika molekul zat terlaruttertentu dalam keadaan terus-menerus bergerak dari fasa diam ke fasa bergerak dan sebaliknya,beberapa molekul karena tidak sama energinya, akan tinggal lebih lama dari yang lainnya dalamfasa bergerak ataupun ada yang tinggal lebih sebentar. Ini akan menghasilkan suatu pita yangmerupakan kurva konsentrasi krakteristik, mirip dengan kurva distribusi.
Keuntungan Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi berkembang menjadi teknik untuk pemisahahan berbagai zat kimia dengan sifat-saifat yang mirip. Oleh karena itu dapat digunakan untuk identifikasi berbagai zat kimia baik secara kuantitatif maupun kualitatif. Keuntungan kromatografi lapis tipis adalah:
- Kromatografi Lapis Tipis hanya memerlukan alat yang sederhana dan mudah didapatkan
- Kromatografi Lapis Tipis merupakan metode pemisahan zat kimia yang mudah dan cepat
- Kromatografi lapis tipis hanya butuh sampel yang sedikit sekali dan pekerjaannya dapat diulang beberapa kali
- Pemisahanan sampel lebih jelas dibandingkan kromatografi kertas
- Hasil pemisahan yang baik ternyata bahwa penyerap dalam kromatografi lapisan tipis mempunyai kapasitas yang lebih besar bila dibandingkan dengan kertas.
Alat dan Bahan Kromatografi Lapis Tipis
Alat
- Beaker Glas
- Chamber
- lampu UV (bila diperlukan analisa dibawah sinar UV)
- Gelas Arloji
- pelat lembaran silika, sekarang ini tinggal beli tidak perlu membuat sendiri
- Neraca
- Spatula
- Kaca Preparat kecil
- Kaca preparat besar ( 20 x 20 cm)
- Gelas Ukur
- Pipet Tetes
- Penyuntik sampel
- Penangas Air
- Corong
- batang Pengaduk
Bahan
- Fase gerak, misal normal heksan (n-heksan)
- Kloroform
- Silica gel (berupa lembaran), hati-hati memegang dengan tangan kosong, pakailah sarung tangan
- sampel
Teknik Kromatografi Lapis Tipis
- Fase diam berupa lembaran silika diberi sampel dengan penyuntik sampel secara hati-hati pada ujung silika.
- Sampel berupa noda akan kering kemudian celupkan dalam fase gerak yang ada dalam bejana
- Bila perlu bejana ditutup
- Pemisahan akan terjadi karena perbedaan afinitas sampel dengan fase diam dan fase gerak
- bila elusi telah selesai pelarut akan dibiarkan menguap
- Bila perlu lakukan pemeriksaan dibawah sinar UV bagi sampel yang diduga berpendar pada sinar UV
Tahapan analisa Kromatografi Lapis Tipis
Tahap-tahap analisa KLT dimulai dari persiapan tangki kromatograf, aplikasi sampel keplat KLT, menjalankan kromatograf dan menentukan nilai Rf. Eluen (fasa gerak/mobile) yagumumnya dipilih berdasarkan ‘trial dan eror” dimasukkan ke dalam tangki kromatograf(chamber)zat yang akan dianalisa ditotolkan diplat klt menggunakan pipa kapiler dan selanjutnyadimasukkan pada chamber yang sudah diisi eluen.
Pertimbangan untuk memilih pelarut pengembang (eluen) umumnya sama denganpemilihan eluen untuk kramatografi kolom. Dalam kromatografi adsorpsi pengelusi eluen naiksejalan dengan polaritasnya (misalnya dari heksana → aseton → alkohol → air). Eluenpengembang dapat berupa pelarut tunggal dan campuran dengan susunan tertentu. Pelarut-pelarut pengembang harus mempunyai kemurnian yang tinggi. Terdapatnya sejumlah kecil airatau zat pengotor lainnya dapat menghasilkan kromatogram yang tidak diharapkan
Tips Kromatografi Lapis Tipis
- Pahami teknik dan dasar teori untuk pemecahan masalah
- Pemilihan eluan yang tepat sangat membantu memperoleh pemisahan senyawa, lakukan studi literatur
- Sampel harus diekstraksi dengan sempurna agar pemisahan sampel lebih baik sehingga mudah dalam identifikasi atau kuantifikasi
- Semakin tinggi nilai Rf maka semakin rendah tingkat kepolarannya, ini dapat dijadikan acuan untuk evaluasi
