Kualifikasi Kinerja Instrument HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Instrument HPLC merupakan instrument yang “wajib” berada pada Laboratorium di sebuah industri farmasi. Instrument ini digunakan untuk menganalisa kadar obat, indentifikasi obat dan penentuan kadar cemaran dalam validasi pembersihan. Selain metode analisis dan kalibrasi, HPLC perlu di kualifikasi untuk memastikan bahwa instrument HPLC dapat bekerja dengan benar sesuai dengan tujuannya.

Ada yang berpendapat bahwa instument HPLC hanya perlu dikalibrasi saja tidak perlu dikualifikasi. Sebenarnya tergantung cara pandang terhadap HPLC ini, bila kita memandang HPLC bagian per bagian HPLC dapat dilakukan kalibrasi. Misalnya kalibrasi detektor, pompa (laju aliran)dan oven pemanas kolom. Kalibrasi bagian perbagian tersebut dilaksanakan secara terpisah dan beranggapan bahwa HPLC dapat terkalibrasi bila semua bagian dikalibrasi serta memenuhi syarat.

Akan tetapi saya memandang bahwa HPLC ini masuk dalam ranah Kualifikasi, mulai dari Kualifikasi Instalasi (KI), Kualifikasi Operasi (KO) dan Kualifikasi Kinerja (KK). Bahkan bisa masuk kedalam Kualifikasi Desain (dimana dijelaskan tentang URSnya). Kenapa HPLC masuk dalam ranah Kualifikasi ? karena menurut saya HPLC ini merupakan insrument yang “sophisticated” intrument rumit dimana masing-masing bagian alat bekerja secara sinergis bersamaan membentuk suatu sistem dan akhirnya menghasilkan suatu output. Mudahnya saya memandang HPLC ini seperti manusia utuh dibandingkan dengan sudut pandang seperti kalibrasi dimana melihat manusia bagian perbagian.ada tangan, ada kepala ada kaki dan lain-lain. Untuk lebih jelasnya perbedaan antar kalibrasi dan kualifikasi bisa dilihat disini.

Saya pernah melakukan Kualifikasi HPLC, mulai dari KD, KI, KO dan KK. Kebetulan waktu itu perusahaan akan membeli unit HPLC baru sehingga saya juga terlibat dalam URS (yang akan masuk dalam KD) sampai unit tersebut siap dan terbukti mampu digunakan untuk analisa rutin. Dalam artikel ini saya akan menjelaskan mengenai Kualifikasi Kinerja saja, untuk KD,KI, dan KO tidak saya jelaskan karena menurut saya termasuk mudah sedangkan KK merupakan “puncak” dari kualifikasi yang menentukan performa unit. Bila KK sukses memenuhi syarat bisa dikatakan KD,KI dan KO “pasti” sudah dilaksanakan dengan benar.

Kualifikasi Kinerja dilakukan dengan menentukan parameter-paremeter kinerja Unit HPLC. Parameter-parameter ini dipilih karena menentukan kinerja HPLC, parameter ini merupakan paremeter kunci yang menandakan apakah HPLC berkerja dengan benar atau tidak dalam analisa rutin. Dalam pemilihan parameter saya mengacu pada:

• manual HPLC
• EQDM QUALIFICATION OF EQUIPMENT ANNEX 1: QUALIFICATION OF HPLC EQUIPMENT, mirror, 
  EDQM terbaru 2018
• Buku Analytical Method Validation and Instrument Performance Verification.

Terutama pada EDQM dijelaskan dengan rinci parameter-parameter dan kriteria penerimaannya. Berikut Tabel Parameter-parameter kualifikasi kinerja HPLC:

Alat dinyatakan terkualifikasi Kinerja bila semua syarat dalam tabel diatas memenuhi syarat spesifikasi. Dalam melakukan kualifikasi kinerja ini sebaiknya dilakukan bersamaan dengan Kualifikasi Operasi sehingga tidak kerja 2 kali. Kualifikasi Operasi dan Kualifikasi Kinerja ini dapat dilakukan bersamaan dan sesuai dengan klausul yang ada di CPOB 2012 pasal 12.17 “Meskipun KK diuraikan sebagai kegiatan terpisah, dalam beberapa
kasus pelaksanaannya dapat disatukan dengan KO”. Dalam pengerjaannya KO dan KK saya lakukan bersamaan, untuk laporannya saya buat terpisah.

Langkah-langkah dalam melakukan KK HPLC.

1. Rancangan Pengambilan Contoh

Untuk mengetahui Kinerja HPLC , maka akan dilakukan uji-uji parameter seperti diatas.
Sebelum dilakukan kualifikasi dibuat dahulu Larutan Caffein Induk 250 ppm 50 ml. Kemudian dari larutan induk diencerkan dibuat seri konsentrasi 10, 15, 20, 25 dan 30 ppm masing-masing dalam labu ukur 20 ml.
Siapkan fase gerak metanol HPLC grade dan Air HPLC grade.

Ini sesuai dengan yg dijelaskan dalam EDQM.

   2. Rancangan Kerja Kualifikasi Kinerja

a. POMPA

¤Uji Akurasi Aliran

1. Fase gerak yang digunakan: air
2. Laju alir yang diuji: 0,5 ml/menit ; 1 ml/menit; 2 ml/menit
3. Uji dilakukan pada kedua pompa secara terpisah
4. Kolom diganti dengan loop khusus yang dapat memberikan tekanan tertentu
5. Atur laju alir pada 0,5 ml/menit
6. Biarkan selama kurang lebih 5-10 menit hingga stabil
7. Timbang labu ukur 5 ml. Pastikan labu ukur bersih dan tidak bersentuhan langsung dengan tangan
8. Hentikan pompa, saluran outlet pembuangan dibersihkan kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur
9. Hidupkan pompa dan hitung waktu dengan stopwatch yang terkalibrasi
10. Pada waktu 5 menit yang tertera pada stopwatch, hentikan pompa
11. Kemudian timbang labu ukur yang telah berisi tersebut
12. Perhitungan:

Berat air = berat labu ukur berisi – berat labu ukur kosong

Volume air = berat air/densitas air pada suhu ruangan kerja

Laju alir = volume air/5 menit

13. Kriteria Penerimaan: laju alir ± 2 %

Lakukan pula pengujian pada laju alir 1 ml/menit dan 2 ml/menit

¤Uji Akurasi Gradient

Bila HPLC dapat melakukan metode gradient dapat dilakukan parameter ini. Metode yaitu Gunakan fase gerak aseton air 0,3%. Channel A : Air dan Channel Siapkan konsentrasi Caffein lakukkan running.

b. DETEKTOR

detektor dalam HPLC bisa detektor UV-Vis atau fluorometri. Dilakukan Uji Akurasi panjang Gelombang dan Uji linearitas Absorbansi.

¤Uji Akurasi Panjang Gelombang

1. Injeksikan larutan Caffein, perhatikan absorbansi yang terbaca pada display, sampai absorbansi stabil
2. Setelah absorbansi stabil, ubah panjang gelombang menjadi 266 nm
3. Baca absorbansi pada display, kemudian catat
4. Ubah panjang gelombang menjadi 267 nm, kemudian baca absorbansinya dan catat
5. Lakukan hal yang sama pada poin 11 dengan panjang gelombang 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, dan 277 nm
6. Panjang gelombang maksimum adalah panjang gelombang yang memberikan absorbansi terbesar. Catat panjang gelombang tersebut

Kriteria penerimaan: panjang gelombang maksimum = 272 ± 2 nm

¤Uji Linearitas Absorbansi

1. Siapkan konsentrasi Caffein lakukkan running
2. gunakan fase gerak metanol air (60:40)
3. Siapkan larutan 10 ppm Caffein, masukkan dalam vial
4. Setting injeksi pada 10 µl, 15 µl, 20 µl, 25 µl dan 30 µl
5. Setiing injeksi sehingga masing masing larutan diambil sebanyak 2 kali
6. Hitung persamaan luas kurva dengan konsentrasi
7. Print hasil analisis
8. Hitung nilai R

c.AUTOINJEKTOR

HPLC sekarang hampir semuanya sudah menggunakan autoinjektor. Untuk HPLC yang belum menggunakan autoinjektor harus dilakukan dengan manual dengan tangan dan injektor.

¤Uji Presisi Volume Injeksi

1. Siapkan larutan 10 ppm Caffein
2. Setting injeksi pada 5 µl, 10 µl dan 50 µl
3. Setting sehingga injektor mengambil sampel 5 µl sebanyak 10 kali
4. Setting sehingga injektor mengambil sampel 10 µl sebanyak 10 kali
5. Hitung luas area

Uji

Lakukan dengan membuat metode pada komputer Atau manual  dengan membuat metode baru dengan parameter setting berikut

6. Timbang vial yang berisi 10 ppm Caffein gunakan pinset untuk mengambil kemudian catat
7. Timbang vial 50 µl ambil dengan pinset, catat hasilnya
8. Setting sehingga injektor mengambil sampel 50 µl sebanyak 10 kali
9. Selesai running Ambil vial menggunakan pinset kemudian timbang catat hasilnya
10. Print dan Hitung RSD dari luas kurva, lakukkan perhitungan presisi volume injeksi hanya pada vial 50 µl.

¤Uji Linearitas Volume Injeksi

Hitung Linearitas dari luas kurva volume injeksi 5 µl, 10 µl dan 50 µl versus luas kurva yang didapat dari Uji Presisi Volume injeksi diatas.

¤Uji Carryover System

Buat metode baru dengan parameter

1. Buat fase gerak metanol 40% dan air 60%
2. Larutan standar Caffein 20 ppm
3. Kolom: C18 15 cm
4. Laju alir: 1,0 ml/menit, Detektor: UV 272 nm  dan Volume injeksi 20 µl
5. Skema Injeksi:
   • Injeksikan larutan standar Caffein 20 ppm
   • Injeksikan fase gerak
   • Injeksikan larutan standar Caffein 20 ppm
   • Injeksikan fase gerak
   • Injeksikan larutan standar Caffein 20 ppm
   • Injeksikan fase gerak
6. Print semua hasil analysis
7. Hitung:

System carryover ditentukan dari kriteria penerimaan berikut ini:

Carryover :Luas area fase gerak x 100%

                        Luas area standar

Hitung masing-masing sehingga akan didapat 3 data carryover

Kriteria penerimaan RSD≤1%

D. OVEN KOLOM

Bila HPLC dilengkapi dengan oven pemanas kolom maka dilakukan uji untuk parameter ini.

Uji Akurasi Suhu

1. Pasang sensor digital thermometer pada bagian ruang oven, pintu oven ditutup.
2. Lakukan setting berikut pada alat oven: suhu 40 °C
3. Tunggu suhu hingga stabil
4. Catat suhu yang tertera pada display alat.
5. Cata suhu yang ada pada thermometer jangan lupa untuk memasukkan faktor koreksi thermometer
6. Kriteria penerimaan: Set Temp. ± 2,0 °C

E. OVERALL SYSTEM PERFORMACE (OSP)

OSP ini merupakan parameter yang sangat penting dalam KK HPLC, OSP merupakan representasi dalam keseluruhan kinerja sistem. OSP ini mewakili semua bagian-bagian yang bekerja secara bersamaan. OSP adalah parameter “pembeda” dari cara pandang kalibrasi HPLC, karena OSP menggambarkan kinerja sistem HPLC secara utuh.

Untuk melihat kesesuaian penggunaan alat secara keseluruhan, maka akan dilakukan pengujian terhadap sistem HPLC untuk melihat parameter Waktu Retensi  dan Area Kromatogram Caffein 50 ppm.

Pastikan uji parameter-parameter pada pompa, detektor, auto injektor dan oven kolom memenuhi syarat. Uji Overall System Performance dilakukan setelah uji-uji tersebut berhasil.

Lakukan System check dengan mengeklik menu Instrument, print hasilnya. Bila PASS lanjutkan uji OSP.

Lakukan uji dengan larutan Caffein 50 ppm, seting injeksi sebanyak 10 kali. Print hasil analisis. Hitung RSD dari retention time dan Luas area.

Kriteria penerimaan RSD≤2%.

Hasil-hasil parameter diatas kemudian diisi dalam lampiran. Bukti hasil print dalam HPLC juga sebaiknya disertakan.Compile semua data diatas dan jadikan dalam LAPORAN KK HPLC.

Bagi yang belum pernah melakukan KK HPLC langkah-langkah diatas mungkin cukup rumit, tapi memang begitu sih. Untuk langkah-langkah diatas mungkin akan berbeda untuk masing-masing instrument dengan merk yang berbeda. Merk Agilent, Shimadzu atau Waters langkah bisa jadi beda akan tetapi prinsipnya mirip.

Semoga Bermanfaat

Salam

M. Fithrul Mubarok,M.Farm.,Apt