Prinsip Kerja HPLC

HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Chromatography, atau dikenal juga dengan istilah KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi). HPLC adalah salah satu teknik analisis yang digunakan untuk mengidentifikasi, memisahkan, dan mengukur konsentrasi zat-zat kimia dalam suatu larutan campuran. Prinsip kerja HPLC perlu dipahami agar pengoperasian HPLC bisa lancar dan mendapatkan solusi trouble shooting. HPLC sering digunakan di bidang farmasi, makanan, biologi, kimia, dan lingkungan.

HPLC merupakan jenis dari kromatografi kolom dan bekerja dengan prinsip yang sama. Prinsip utama dari kromatografi kolom adalah adanya adsorbsi (penempelan permukaan) dari solut (cairan sampel) ke dalam larutan melalui fase diam yang menyebabkan adanya pemisahan solut dengan larutan.

Fase diam adalah suatu bahan padat atau cair yang ditempatkan di dalam kolom kromatografi. Fase diam berfungsi sebagai media pemisahan yang memiliki afinitas yang berbeda terhadap komponen-komponen dalam sampel. Fase gerak adalah suatu cairan atau gas yang dipompa melalui kolom kromatografi dengan tekanan tinggi. Fase gerak berfungsi sebagai media pengangkut yang membawa sampel melewati fase diam.

Ketika sampel disuntikkan ke dalam kolom kromatografi, komponen-komponen dalam sampel akan berinteraksi dengan fase diam dan fase gerak. Komponen-komponen yang memiliki afinitas yang lebih besar terhadap fase diam akan tertahan lebih lama di dalam kolom, sedangkan komponen-komponen yang memiliki afinitas yang lebih besar terhadap fase gerak akan keluar lebih cepat dari kolom. Dengan demikian, komponen-komponen dalam sampel akan terpisah berdasarkan waktu retensi (waktu yang dibutuhkan untuk keluar dari kolom).

Komponen-komponen yang keluar dari kolom akan dideteksi oleh detektor yang terhubung dengan kolom. Detektor akan menghasilkan sinyal yang proporsional dengan konsentrasi komponen. Sinyal-sinyal ini akan direkam oleh rekorder atau komputer dalam bentuk kromatogram. Kromatogram adalah grafik yang menunjukkan hubungan antara waktu retensi dengan intensitas sinyal. Kromatogram dapat digunakan untuk mengidentifikasi dan mengukur konsentrasi komponen-komponen dalam sampel.

Bagian-Bagian HPLC

Instrument HPLC terdiri dari beberapa bagian utama, yaitu:

Reservoir, tempat menyimpan fase gerak.
Pompa, alat yang mengalirkan fase gerak ke dalam kolom dengan tekanan tinggi.
Injektor, alat yang digunakan untuk menyuntikkan sampel ke dalam aliran fase gerak.
Kolom, tabung yang berisi fase diam yang berfungsi sebagai media pemisahan.
Detektor, alat yang digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen yang keluar dari kolom.
Rekorder atau komputer, alat yang digunakan untuk merekam dan menampilkan kromatogram.

Jenis-Jenis HPLC

Berdasarkan jenis fase diam yang digunakan, HPLC dapat dibedakan menjadi beberapa jenis, antara lain:

HPLC Normal Phase (NP), menggunakan fase diam polar dan fase gerak non-polar. Contoh fase diam adalah silika gel, alumina, atau sianopropil. Contoh fase gerak adalah heksana, kloroform, atau etil asetat. HPLC NP cocok untuk memisahkan komponen-komponen yang polar.
HPLC Reverse Phase (RP), menggunakan fase diam non-polar dan fase gerak polar. Contoh fase diam adalah silika gel yang dimodifikasi dengan gugus alkil, seperti C8 atau C18. Contoh fase gerak adalah air, metanol, atau asetonitril. HPLC RP cocok untuk memisahkan komponen-komponen yang non-polar atau hidrofobik.
HPLC Ion Exchange (IE), menggunakan fase diam yang bermuatan positif atau negatif dan fase gerak yang mengandung garam. Contoh fase diam adalah resin kationik atau anionik. Contoh fase gerak adalah larutan natrium klorida, asam asetat, atau amonium hidroksida. HPLC IE cocok untuk memisahkan komponen-komponen yang bermuatan, seperti asam amino, protein, atau nukleotida.
HPLC Size Exclusion (SE), menggunakan fase diam yang berpori dan fase gerak yang netral. Contoh fase diam adalah gel polimer, seperti dekstran, agarosa, atau polistiren. Contoh fase gerak adalah larutan garam, buffer, atau air. HPLC SE cocok untuk memisahkan komponen-komponen berdasarkan ukuran molekul, seperti polimer, peptida, atau asam nukleat.

Kelebihan HPLC

HPLC memiliki beberapa kelebihan dibandingkan dengan teknik analisis lainnya, antara lain:

HPLC dapat digunakan untuk menganalisis zat-zat yang tidak mudah menguap, termasuk zat-zat yang berat molekulnya besar, seperti protein, peptida, atau asam nukleat.
HPLC dapat digunakan untuk menganalisis zat-zat yang sensitif terhadap suhu tinggi, seperti vitamin, hormon, atau antibiotik.
HPLC dapat digunakan untuk menganalisis zat-zat yang memiliki polaritas yang beragam, dari yang sangat polar hingga yang sangat non-polar.
HPLC memiliki sensitivitas dan selektivitas yang tinggi, sehingga dapat mendeteksi zat-zat dalam konsentrasi yang sangat rendah, bahkan sampai ppm atau ppb.
HPLC memiliki presisi dan akurasi yang tinggi, sehingga dapat menghasilkan hasil yang konsisten dan dapat dipercaya.
HPLC memiliki variasi metode yang luas, sehingga dapat disesuaikan dengan kebutuhan analisis yang spesifik.

Aplikasi HPLC

HPLC memiliki banyak aplikasi di berbagai bidang, antara lain:

Di bidang farmasi, HPLC digunakan untuk menguji kualitas, kemurnian, dan stabilitas obat-obatan, baik bahan baku, bahan antara, maupun produk jadi. HPLC juga digunakan untuk mengidentifikasi dan mengukur zat-zat terkait, seperti metabolit, degradasi, atau kontaminasi dalam obat-obatan.
Di bidang makanan, HPLC digunakan untuk menguji kandungan nutrisi, aditif, pewarna, pengawet, atau racun dalam makanan dan minuman. HPLC juga digunakan untuk mengontrol kualitas dan kesesuaian standar produk makanan dan minuman.
Di bidang biologi, HPLC digunakan untuk mengisolasi, mengidentifikasi, dan mengukur biomolekul, seperti asam amino, protein, enzim, hormon, vitamin, atau asam nukleat. HPLC juga digunakan untuk menganalisis interaksi antara biomolekul, seperti afinitas, aktivitas, atau inhibisi.
Di bidang kimia, HPLC digunakan untuk mengkarakterisasi, mengidentifikasi, dan mengukur senyawa-senyawa organik atau anorganik, baik yang alami maupun sintetis. HPLC juga digunakan untuk menganalisis reaksi-reaksi kimia, seperti kinetika, mekanisme, atau katalisis.
Di bidang lingkungan, HPLC digunakan untuk menguji kualitas, polusi, atau kontaminasi air, tanah, udara, atau limbah. HPLC juga digunakan untuk mengidentifikasi dan mengukur zat-zat berbahaya, seperti pestisida, herbisida, logam berat, atau senyawa organik volatil.

Kesimpulan

HPLC adalah salah satu teknik analisis yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi,memisahkan, dan mengukur konsentrasi zat-zat kimia dalam suatu larutan campuran. HPLC memiliki banyak kelebihan dan aplikasi di berbagai bidang, seperti farmasi, makanan, biologi, kimia, dan lingkungan. HPLC bekerja dengan prinsip adsorbsi dari solut ke fase diam yang menyebabkan adanya pemisahan solut dengan larutan. HPLC terdiri dari beberapa bagian utama, yaitu reservoir, pompa, injektor, kolom, detektor, dan rekorder atau komputer. HPLC dapat dibedakan menjadi beberapa jenis, berdasarkan jenis fase diam yang digunakan, yaitu HPLC Normal Phase, HPLC Reverse Phase, HPLC Ion Exchange, dan HPLC Size Exclusion.

Prinsip Kerja HPLC