Pengembangan analisis suatu zat tidak mudah menggunakan HPLC sebagai instrumentnya. Pengembangan metode analisis HPLC merupakan tahapan penting dalam analisis obat di farmasi.
Terdapat banyak faktor-faktor yang mempengaruhi pengembangan metode analisis diantaranya :
- Tipe kolom
- Prameter operasi
- Komposisi fase gerak
- nilai pH
Adanya faktor-faktor diatas yang saling terkait sehingga tidak mudah mengembangkan metode analisis baru untuk obat.
Metode analisis HPLC obat idealnya cukup sederhana, menggunakan kolom yang umum tersedia, menggunakan fase gerak yang umum dan buffer yang umum.
Metode analisis adalah salah satu proses paling penting dalam pengembangan dan produksi produk obat. Pengembangan metode analisis HPLC ini memainkan peran kunci dalam mendukung pengembangan dan proses produksi lainnya di semua tahap siklus hidup produk obat. Sangat penting bahwa metode analitis tepat, akurat, dan dapat diandalkan, sehingga cocok untuk tujuan yang dimaksudkan.
Langkah-langkah pengembangan Metode Analisis HPLC
1. Pemilihan Metode Analisis HPLC
Pertama adalah studi literatur semacam Farmakope Indonesia VI, USP, EP dan JP. Dapat juga membaca jurnal-jurnal terkait dengan metode analisis untuk zat obat tersebut. Dengan banyaknya bacaan akan memudahkan memahami zat tersebut dan dapat menumbuhkan ide-ide terkait dengan metode analisis yang cocok.
Preparasi sampel
Pilih metode untuk menyiapkan sampel berdasarkan tingkat kelarutan sampel, kebutuhan penyaringan sampel dan kebutuhan adanya ekstraksi sampel.
Kromatografi
Kromatografi fase terbalik biasanya digunakan untuk banyak sampel.Fase diam yang sering diapakai adalah kolom C18. Fase kromatografi normal digunakan untuk analit dengan polaritas rendah dan menengah terutama untuk pemisahan analit dengan isomer.
Pilih fase normal cyano untuk pemisahannya. Kromatografi pertukaran ion paling cocok untuk anion inorganik atau analisis kation. Jika analit mempunyai berat molekul yang tinggi, pemisahan dan analisis dapat menggunakan kromatografi ekslusi.
HPLC Grandien atau Isotonik
HPLC gradient sangat berguna dalam analisis sampel yang kompleks yang mempunyai banyak komponen. Dengan gradient HPLC akan mendapatkan resolusi yang tinggi daripada dengan HPLC isotonik. HPLC gradient mempunyai sensitivitas tinggi terutama untuk produk yang mempunyai waktu retensi yang lama
Ukuran Kolom
Ukuran kolom 100-150 nm digunakan untuk kebanyakan sampel. Dengan ukuran ini dapat menurunkan waktu analisis sampel. Kolom yang lebih besar digunakan untuk sampel yang kompleks yang membutuhkan waktu pemisahan lebih lama. Sebagai wal, kecepatan aliran diaga diantara 1-1,5 ml/menit dan ukuran partikel pada kolom antara 3-5 μm.
Detektor HPLC
Bila analisi mempunyai gugus kromofor pada senyawanya akan lebih mudah pemeriksaan menggunakan detektor UV. Detektor UV lebih dipilih dibandingkan dengan detektor jenis lain. Detektor fluorosense dan elektrokimia digunakan untuk analisis zat dengan kadar kecil (trace element). Sampel dengan konsentrasi tinggi harus dianalisis dengan detektor refraktif.
Panjang Gelombang
Panjang gelombang λmaksimal pada sampel punya sensitivitas kuat pada cahaya UV. Sehingga akan mendeteksi komponen sampel yang mempunyai kromofor. Panjang gelombang diatas 200 nano meter mempunyai sensivitas tinggi daripada panjang gelombang lainnya. Panjang gelombang kurang dari 200 nano meter akan memberikan banyak gangguan sehingga lebih baik dihindari.
Pemilihan Kondisi Kromatografi
Setelah pemilihan metode analisis, berbagai kondisi kromatografi dapat dipilih.
Aliran analit melalui kolom tergantung pada konsentrasi pelarut dalam fase gerak. Konsentrasi pelarut umumnya digunakan untuk mengontrol waktu retensi. pH fase gerak dan reagen ion, juga mempengaruhi waktu retensi sampel. Sampel yang memiliki sejumlah besar komponen dianalisis menggunakan kondisi gradien untuk menghindari waktu retensi besar, sementara sampel yang mengandung satu atau dua komponen dianalisis pada sistem isotonik.
Optimasi Parameter HPLC
Setelah sampel dianalisis dengan menggunakan beberapa parameter pada HPLC, maka ukuran kolom, ukuran partikel, waktu analisis dan kecepatan aliran harus dioptimasi. Optimasi dengan tujuan mendapatkan resolusi kromatogram yang abgus dan analisis yang singkat.
Setelah dilakukan optimasi metode analisis, maka metodenya di validasi untuk memastikan konsistensi analisisnya. Validasi Metode Analisis ini wajib dilakukan menurut CPOB 2018.
Biasanya, pengembangan dan validasi metode dilakukan di satu laboratorium, dan analisis rutin yang sedang berlangsung dilakukan di laboratorium lain. Di sini, kinerja metode yang tidak konsisten dapat membuat langkah transfer metode menjadi penting karena banyak faktor yang terlibat (sistem LC yang berbeda, batch kolom dan / atau pelarut yang berbeda, variabilitas yang dapat dikaitkan dengan analis, dll.). Faktor-faktor ini dapat secara signifikan mempengaruhi operasi metode dalam penggunaan rutin, menyebabkan hasil out-of-trend (OOT) atau out-of-specification (OOS). (9)
Semoga Bermanfaat
Salam
M. Fithrul Mubarok, M. Farm.,Apt
Sumber:https://www.pharmaguideline.com/2015/10/procedure-to-develop-hplc-method.html
