Kualifikasi Kinerja Spektrofotometer UV/Vis

Spektrofotometer UV/Vis merupakan Instrument yang selalu ada di laboratorium analisis termasuk di Industri Farmasi. Instrument ini digunakan untuk analisis berbagai jenis produk obat, analisis ini termasuk analisis kadar sediaan obat. Kadar obat ini merupakan salah satu parameter penting dalam obat yang berpengaruh pada perilisan obat oleh industri ke konsumen. Oleh karena itu perlu dipastikan bahwa instrumen pengukuran spektrofotometer terkualifikasi sesuai dengan spesifikasinya. Dalam analisis setelah instrument terkualifikasi kinerja baru dilakukan validasi metode analisis.

Kualifikasi kinerja (KK) merupakan tahapan puncak dari rangkaian kualifikasi yang meliputi Kualifikasi desain(KD), instalasi(KI), operasi (KO). KK ini merupakan tahap yang paling susah dalam kualifikasi, sebelum melakukan KK iniharus dipastikan bahwa KD, KI dan KO telah sesuai dan disetujui manager.Untuk contoh rangkaian KD,KI,KO dan KK dapat dibaca disini. Ada yang berpendapat bahwa spektrofotometer UV/Vis masuk ke dalam ranah kalibrasi bukan kualifikasi, akan tetapi saya berpendapat bahwa spektrofotometer masuk dalam ranah kualifikasi karena instrument ini cukup kompleks dan terhubung dengan komputer untuk pengaturan(bisa komputer internal dalam alat atau desktop PC). Dalam Farmasi termasuk dalam Instrument analitik grup C sehingga masuk dalam ranah kualifikasi.

Parameter-parameter Kualifikasi Kinerja:

Parameter-parameter dan kriteria penerimaan KK spektrofotometer UV/Vis harus ditentukan dahulu dan dituangkan dalam protokol KK. Setelah dibuat protokol KK dan disetujui bagian terkait, laksanakan protokol dan ambil data kemudian dituangkan dalam laporan KK. Parameter yang ditentukan tentu harus berdasarkan guideline yang ada. Metode, parameter, dan cara uji diadopsi dari EDQM Annex 3 dan Buku Analytical Method Validation and Instrument Performance Verification. Berikut parameter-parameternya:

Dalam KK ini dilakukan pada Spektrofotometer Double Beam, untuk single beam dapat menyesuaikan. Untuk Prosedur detail mungkin berbeda antara merk spektrofotometer akan tetapi pada prinsipnya sama, oleh karena perlu dipahami manual book dan SOP masing-masing merk-tipe spektrofotometer.

Berikut ini adalah prosedur kualifikasi kinerja spektrofotometer :

A.Akurasi panjang gelombang

Bahan       : Glass Filter Holmium Oxide

Persiapan:

1. Sambungkan alat dengan sumber listrik 220 volt.
2. Tekan tombol Power ke posisi ON, biarkan selama ± 15 menit hingga alat stabil.
3. Masukkan parameter sebagai berikut :
   1. Pada data menu pilih : SPECTRUM, dengan menekan tombol angka 2
   2. Isikan parameter sebagai berikut :
      1. Meas Mode: ABS
      2. Scanning Range: 700 nm ~ 225 nm
      3. Rec. Range: 0,00 A ~ 2,00 A
      4. Scan speed: FAST
      5. No. Of scans: 1
      6. Display mode: SEQUENTIAL

 Prosedur Kualifikasi :
1. Buka jendela spektrofotometer.
2. Pasang Glass Filter Holmium oxide pada tempat kuvet sampel, blanko udara.
3. Tutup jendela spektrofotometer.
4. Tekan START.
5. Biarkan alat mengukur absorbansi dari panjang gelombang 700 – 225 nm.
6. Tekan F2 (data proc)
7. Tekan PRINT
8. Tekan 3 (peak)
9. Tekan PRINT

B.Presisi panjang gelombang

1. Lakukan pengukuran yang sama pada akurasi panjang gelombang sebanyak 6 kali
2. Catat panjang gelombang serapan maksimum dan absorbansinya

C.Akurasi fotometrik

Bahan:

• H₂SO₄ 0,005 M
• K₂Cr­₂­O₇

Persiapan:

1. Pembuatan larutan H₂SO₄ 0,005 M:
   1. Pipet 0,28 ml H₂SO₄ pekat (18 M) ke dalam labu ukur 1 L
   2. Encerkan sampai tanda batas menggunakan aquadest
   3. Kocok hingga homogen
2. Pembuatan larutan K₂Cr₂O₇ 60 mg/L
   1. Timbang 12 mg K₂Cr₂O₇ masukkan ke dalam labu ukur 200 ml
   2. Larutkan dengan menggunakan larutan H₂SO₄ 0,005 M, encerkan hingga tanda batas dengan larutan H₂SO₄ 0,005 M
   3. Kocok hingga homogen
3. Pembuatan larutan K₂Cr₂O₇ 600 mg/L
   1. Timbang 60 mg K₂Cr₂O₇ masukkan ke dalam labu ukur 100 ml
   2. Larutkan dengan menggunakan larutan H₂SO₄ 0,005 M, encerkan hingga tanda batas dengan larutan H₂SO₄ 0,005 M
   3. Kocok hingga homogen
4. Sambungkan alat dengan sumber listrik 220 volt.
5. Tekan tombol Power ke posisi ON, biarkan selama ± 15 menit hingga alat stabil

Prosedur kualifikasi:

1. Tekan angka 1 (PHOTOMETRIC)
2. Tekan F3 (Smpl meas)
3. Tekan GO TO WL, kemudian atur panjang gelombang pada 430 nm, tekan ENTER
4. Tekan AUTOZERO
5. Buka jendela spektrofotometer
6. Letakkan kuvet blanko berisi larutan H₂SO₄ 0,005 M pada posisi blanko
7. Letakkan kuvet berisi larutan K₂Cr₂O₇ 600 mg/L pada posisi sampel
8. Tutup jendela spektrofotometer
9. Tekan START
10. Buka jendela spektrofotometer
11. Keluarkan kuvet sampel dan blanko
12. Atur panjang gelombang pada 350 nm
13. Tekan AUTOZERO
14. Buka jendela spektrofotometer
15. Masukkan kuvet blanko berisi larutan H₂SO₄ 0,005 M pada posisi blanko
16. Letakkan kuvet berisi larutan K₂Cr₂O₇ 60 mg/L pada posisi sampel
17. Tutup jendela spektrofotometer
18. Tekan START
19. Buka jendela spektrofotometer
20. Keluarkan kuvet sampel dan blanko
21. Atur panjang gelombang pada 313 nm
22. Tekan AUTOZERO
23. Buka jendela spektrofotometer
24. Masukkan kuvet blanko berisi larutan H₂SO₄ 0,005 M pada posisi blanko
25. Letakkan kuvet berisi larutan K₂Cr₂O₇ 60 mg/L pada posisi sampel
26. Tutup jendela spektrofotometer
27. Tekan START
28. Buka jendela spektrofotometer
29. Keluarkan kuvet sampel dan blanko
30. Atur panjang gelombang pada 257 nm
31. Tekan AUTOZERO
32. Buka jendela spektrofotometer
33. Masukkan kuvet blanko berisi larutan H₂SO₄ 0,005 M pada posisi blanko
34. Letakkan kuvet berisi larutan K₂Cr₂O₇ 60 mg/L pada posisi sampel
35. Tutup jendela spektrofotometer
36. Tekan START
37. Buka jendela spektrofotometer
38. Keluarkan kuvet sampel dan blanko
39. Atur panjang gelombang pada 235 nm
40. Tekan AUTOZERO
41. Buka jendela spektrofotometer
42. Masukkan kuvet blanko berisi larutan H₂SO₄ 0,005 M pada posisi blanko
43. Letakkan kuvet berisi larutan K₂Cr₂O₇ 60 mg/L pada posisi sampel
44. Tutup jendela spektrofotometer
45. Tekan START
46. Buka jendela spektrofotometer
47. Keluarkan kuvet sampel dan blanko
48. Absorbansi yang terbaca pada masing-masing uji dicatat, kemudian dikonversi menjadi nilai absorbansi spesifik dengan menggunakan persamaan:

Keterangan:

C = persen konsentrasi (W/V) à 0,006% = 60 mg/L ; 0,06% = 600 mg/L

d = path length (cm) –> 1 cm

D.Linieritas fotometrik

Bahan:

• H₂SO₄ 0,005 M
• K₂Cr­₂­O₇

Persiapan:

1. Pembuatan larutan H₂SO₄ 0,005 M:
   • Pipet 0,28 ml H₂SO₄ pekat (18 M) ke dalam labu ukur 1 L
   • Encerkan sampai tanda batas menggunakan aquadest
   • Kocok hingga homogen
2. Pembuatan larutan induk K₂Cr₂O₇ dengan konsentrasi 100 mg/L:
   • Timbang 10 mg K₂Cr₂O₇ masukkan ke dalam labu ukur 100 ml
   • Larutkan dengan menggunakan larutan H₂SO₄ 0,005 M, encerkan hingga tanda batas dengan larutan H₂SO₄ 0,005 M
   • Kocok hingga homogen
3. Pembuatan seri larutan uji:

a.Konsentrasi 20 mg/L

1. • Pipet 2 ml larutan induk, masukkan ke dalam labu ukur 10 ml
   • Encerkan hingga tanda batas menggunakan larutan H₂SO₄ 0,005 M

b. Konsentrasi 40 mg/L

•  Pipet 4 ml larutan induk, masukkan ke dalam labu ukur 10 ml
• Encerkan hingga tanda batas menggunakan larutan H₂SO₄ 0,005 M

c. Konsentrasi 60 mg/L

• Pipet 6 ml larutan induk, masukkan ke dalam labu ukur 10 ml
• Encerkan hingga tanda batas menggunakan larutan H₂SO₄ 0,005 M

d. Konsentrasi 80 mg/L

• Pipet 4 ml larutan induk, masukkan ke dalam labu ukur 5 ml
• Encerkan hingga tanda batas menggunakan larutan H₂SO₄ 0,005 M

4. Sambungkan alat dengan sumber listrik 220 volt.

5. Tekan Power ke posisi ON dan biarkan selama ± 15 menit hingga alat stabil.

Prosedur pengujian:

1. Atur panjang gelombang pada 350 nm
2. Tekan AUTOZERO
3. Buka jendela spektrofotometer
4. Letakkan kuvet berisi larutan H₂SO₄ 0,005 M pada posisi blanko
5. Letakkan kuvet berisi larutan K₂Cr₂O₇ pada posisi sampel
6. Ukur absorbansi larutan uji mulai dari konsentrasi 20 mg/L hingga 100 mg/L
7. Pengukuran dilakukan sebanyak 3 kali untuk masing-masing konsentrasi
8. Ulangi langkah 1 hingga 7 untuk panjang gelombang 313, 257, dan 235 nm
9. Buat persamaan regresi linier untuk masing-masing panjang gelombang

D.Pengujian stray light

Bahan:

• NaNO₂
• Aquadest

Persiapan:

1. Pembuatan larutan NaNO₂ dengan konsentrasi 50 gram/L:
   • Timbang 1 gram NaNO₂, masukkan ke dalam labu ukur 20 ml
   • Larutkan dengan menggunakan aquadest, encerkan hingga tanda batas
   • Kocok hingga homogen
2. Sambungkan alat dengan sumber listrik 220 volt.
3. Tekan Power ke posisi ON dan biarkan selama ± 15 menit hingga alat stabil

Prosedur pengujian:

1. Atur panjang gelombang pada 340 nm
2. Tekan AUTOZERO
3. Buka jendela spektrofotometer
4. Letakkan kuvet berisi aquadest pada posisi blanko
5. Letakkan kuvet berisi larutan NaNO₂ 50 gram/L pada posisi sampel
6. Ukur absorbansi larutan NaNO₂ 50 gram/L
7. Buka jendela spektrofotometer, keluarkan kuvet
8. Catat absorbansi yang terbaca

E.Pengujian noise

Persiapan:

1. Sambungkan alat dengan sumber listrik 220 volt
2. Tekan POWER ke posisi ON dan biarkan selama ± 15 menit hingga alat stabil
3. Pastikan tidak ada yang keluar masuk ruangan pada saat pengujian berlangsung dan tidak ada yang mondar-mandir di depan alat.

Prosedur pengujian:

1. Atur MODE pada TIMESCAN MODE
2. Atur panjang gelombang pada 500 nm
3. Atur waktu scan selama 10 menit (600 sec)
4. Posisi sampel dan blanko diisi udara (tanpa kuvet)
5. Tekan START
6. Hitung nilai RMS noise dengan cara mengkalikan nilai peak-to-peak noise level tertinggi dengan faktor 0,7

F.Pengujian absorption cells

Bahan       : Aquadest

Persiapan:

1. Sambungkan alat dengan sumber listrik 220 volt
2. Tekan POWER ke posisi ON dan biarkan selama ± 15 menit hingga alat stabil

Prosedur pengujian:

1. Atur panjang gelombang pada 240 nm
2. Tekan AUTOZERO
   • Buka jendela spektrofotometer
   • Letakkan kuvet berisi aquadest pada posisi sampel
   • Biarkan posisi balnko kosong (blanko udara)
   • Ukur absorbansinya
   • Buka jendela spektrofotometer
   • Putarkan kuvet 180°, kemudian letakkan pada posisi sampel
   • Ukur absorbansinya
   • Hitung selisih absorbansi pada pembacaan pertama dan kedua

G.Pengujian baseline flatness

Persiapan:

1. Sambungkan alat dengan sumber listrik 220 volt
2. Tekan POWER ke posisi ON dan biarkan selama ± 15 menit hingga alat stabil

Prosedur pengujian:

1. Pilih menu SPECTRUM dengan menekan tombol angka 2
2. Isikan parameter sebagai berikut:
   • Meas mode: ABS
   • Scanning range: 800 ~ 200 nm
   • Rec range: -0,01 ~ 0,01 A
   • Scan speed: FAST
   • Of Scans: 1
   • Display mode: SEQUENTIAL
3. Buka jendela spektrofotometer
4. Posisi sampel dan blanko diisi udara (tanpa kuvet), tutup jendela spektrofotometer
5. Tekan START, biarkan alat mengukur absorbansi dari panjang gelombang 800-200 nm
6. Tekan F2 (data proc), kemudian tekan PRINT
7. Hitung defleksi (penyimpangan) tertinggi dan terendah

Untuk Contoh hasil dan evaluasi KK spektrofotometer bisa dilihat disini.

Pengalaman saya melakukan KK diatas benar-benar harus disiapkan bahan-bahan dan alat yang dibutuhkan sebelum eksekusi KK. Biasanya juga tidak selalu berhasil pada percobaan pertama karena ini membutuhkan keahlian dan pengalaman yang cukup.

Semoga bermanfaat

Salam

M. Fithrul Mubarok,S.Farm.,Apt

Sumber:

• EDQM Annex 3
• Analytical Method Validation and Instrument Performance Verification.