Dalam dunia analisis HPLC degassing sangat penting, gelembung udara bukanlah sekadar gangguan kecil, melainkan penyebab utama dari berbagai masalah teknis yang dapat mengganggu hasil pengujian.
Apa itu degassing ?
Degassing, proses penghilangan gas terlarut, menjadi kunci untuk memastikan aliran pelarut yang stabil dan hasil yang dapat diandalkan. Tanpa degassing, gelembung udara yang terbentuk saat pencampuran pelarut bisa mengacaukan garis dasar detektor, mengurangi akurasi laju aliran pompa, dan bahkan menyebabkan kegagalan pompa karena tekanan berlebih. Lebih jauh lagi, gelembung-gelembung ini bisa menyebabkan puncak palsu pada detektor dan mengganggu perpindahan aliran pelarut melalui kolom HPLC, menghasilkan apa yang disebut ‘volume mati’. Untuk memahami bagaimana masalah ini bisa terjadi, kita harus ingat bahwa pelarut cenderung menyerap gas atmosfer ketika terpapar di laboratorium. Saat pelarut dicampur, kelarutan udara menurun, dan gelembung udara pun muncul, siap untuk menimbulkan kekacauan dalam analisis yang cermat.
Pelepasan gas dapat terjadi pada pencampuran atau dimana saja dalam sistem kromatografi cair dimana permukaan kasar menghasilkan tempat nukleasi untuk pembentukan gelembung. Secara praktis tidak perlu menghilangkan seluruh udara terlarut tetapi hanya sebagian kecil yang dapat dihilangkan untuk menurunkan tingkat lewat jenuh dalam fase gerak.
Sistem pencampuran bertekanan rendah lebih rentan terhadap pembentukan gelembung. Dalam pencampuran tekanan rendah, pelarut dicampur pada tekanan atmosfer dan pelepasan gas dapat terjadi di mana saja di sepanjang jalur aliran.
Sebaliknya pada pelarut bertekanan tinggi pencampuran dicampur setelah melewati pompa dan pencampuran berlangsung di bawah tekanan tinggi dalam ruang pencampuran.
Campurannya mungkin jenuh tetapi pelepasan gas pada tekanan tinggi dapat dicegah. Pembentukan gelembung, jika ada, dapat terjadi ketika fase gerak keluar dari kolom dan kembali ke tekanan atmosfer.
Teknik Degassing
Praktik degassing yang umum digunakan untuk fase gerak HPLC adalah:
- Pembersihan helium
- Degassing vakum
- Sonikasi
Mendidihkan adalah teknik yang paling efektif untuk menghilangkan udara terlarut sepenuhnya tetapi tidak pernah disarankan karena hilangnya komponen-komponen yang mudah menguap bersama dengan gas-gas dan juga memerlukan waktu yang lama untuk menyeimbangkan fase gerak ke kondisi suhu lingkungan yang diperlukan.
Pembersihan Helium menghilangkan hingga 80% udara terlarut. Untuk fase gerak organik – berair, volume helium yang sama untuk pembersihan sudah cukup. Laju pasokan helium dapat dikurangi seiring waktu karena pembersihan yang berlebihan dapat menyebabkan hilangnya komponen fase gerak yang lebih mudah menguap.
Degassing Vakum menghilangkan lebih dari 60% udara terlarut. Salah satu pilihannya adalah menerapkan vakum selama filtrasi fase gerak melalui filter membran porositas 0,45 atau 0,22μm.
Degassing vakum online tersedia di sebagian besar sistem komersial yang tersedia. Fase gerak dilewatkan melalui pipa polimer berpori yang ditempatkan dalam ruang vakum di dalam HPLC. Porositas pipa memungkinkan keluarnya gas melalui dinding tetapi cairan tetap tertahan di dalam pipa.
Sonikasi menggunakan rendaman ultrasonik umum dilakukan di sebagian besar laboratorium tetapi sebagai teknik yang berdiri sendiri, sonikasi hanya menghilangkan hingga 30% udara terlarut sehingga sonikasi yang dikombinasikan dengan teknik lain direkomendasikan.
Untuk tujuan praktis disarankan untuk menghilangkan gas fase gerak dalam sistem pencampuran tekanan rendah dan tinggi dan kombinasi teknik yang berbeda dapat menghilangkan sebagian besar masalah yang terkait dengan pembentukan gelembung.
Karena degassing vakum online ditawarkan pada sebagian besar sistem yang tersedia secara komersial, sonikasi yang dikombinasikan dengan degassing online memberikan hasil yang memuaskan.
